0 引言 Introduction
股骨头坏死是骨科常见的疑难病之一，其发病原因尚不明确，可分为创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死2 大类，临床表现为髋关节疼痛、跛行及功能障碍[1]。目前，股骨头坏死的治疗主要是药物保守治疗和手术疗法。药物治疗仅局限于改善临床症状，而手术治疗一般采用髓芯减压和全髋关节置换等修复方法，存在创伤大、费用高及术后并发症多等缺陷。中医药对股骨头坏死的治疗有积极作用，尤其对于早中期患者，可延缓病程进展，有效改善患者临床症状，推迟全髋关节置换的时间[2]。中医学认为本病属于“骨蚀”“骨痹”“骨痿”范畴，致病原因以痰、瘀、虚为主，与肝、脾、肾密切相关，病机多属肝肾亏虚，气滞血瘀，治疗上多以补益肝肾，活血化瘀为主，使肝肾之气充盈，瘀血散去，经络通畅，骨得营血之濡养。
补肾活血汤，出自《伤科大成》，由红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂共11 味中药组方而成，有补益肝肾、强筋壮骨、活血止痛之功效。补肾活血汤以及其化裁方在长期的临床实践中取得了较好的疗效。曾宪峰等[3]通过随机平行对照研究发现补肾活血汤可显著改善髋关节症状，疗效明显；滕佳文[4]根据临床病例观察证实补肾活血汤可明显减轻髋部疼痛，还能改善血液微循环、纠正脂质代谢紊乱；张翔等[5]实验说明补肾活血方可通过调节APNAMPK 信号通路中脂联素、肿瘤坏死因子α 的表达，对股骨头坏死发挥有效干预。
网络药理学是以系统生物学为基础，对特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调药物的多分子多靶标多途径调节，提升药物疗效，降低毒副作用，从而提高新药研发效率，节省药物的研发费用[6-7]。
由于补肾活血汤中药物所含化学成分多且较为复杂，并且在分子水平上治疗股骨头坏死的作用机制尚不明确，因此文章拟通过网络药理学从分子水平探究补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在活性成分及作用机制，为后期的深入研究、实验验证及新药研发提供一定的理论依据。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 补肾活血汤中成分收集与筛选 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php) 和中医药综合数据库(TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，以“红花”“当归”“肉苁蓉”“山茱萸”“枸杞子”“菟丝子”“熟地黄”“杜仲”“没药”“独活”“补骨脂”为关键词检索补肾活血汤中的化学成分，其中“补骨脂”的化学成分从TCMID 中获得。
口服生物利用度是ADME 中重要的药动学参数之一，它表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，口服生物利用度值越高通常表示药物的类药性越好[8-9]。因此筛选出红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂化合物中符合口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18 的化学成分作为活性成分。
1.2 靶标蛋白的筛选及药物-归经-化合物-靶点网络的构建 将筛选出的补肾活血汤中的活性成分输入到TCMSP平台进行检索(其中补骨脂活性成分的靶标蛋白通过TCMID 获取)，查找出相关靶标蛋白，借助Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)查询靶标蛋白对应的基因名[10]，进行标准化处理。通过查询《中华人民共和国药典》[11]，明确补肾活血汤中各药物归经，并用Cytoscape 3.7.2 软 件(https://cytoscape.org/)，构建“药物-归经-活性成分-靶点”网络并分析。
1.3 补肾活血汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测 在GeneCards Version 4.14数 据 库(https://www.genecards.org/)和CTD 毒性与基因比较数据库(http://ctdba
se.org/)中[12-13]，以“Osteo
necrosis of the femoral head”为关键词，规定物种为“Homo Sapiens”，检索与股骨头坏死相关疾病靶点。通过韦恩图将“1.2”中筛选出的药物靶点与相关疾病靶点进行映射取交集，得到补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。
1.4 蛋白互作(PPI)网络构建及蛋白模块筛选与分析 将“1.3”项下得到的交集靶点导入STRING 数据库(https://string-db.org/)[14]， 选 择“Multiple Proteins” 并 将“Organism” 规 定 为“Homo sapiens”， 获 得 蛋 白 互 作关系，数据保存为TSV 格式。利用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，“Network analyzer”功能进行网络拓扑属性分析。运用Cytoscape 3.7.2 软件的MCODE 插件筛选PPI 中的蛋白模块[15]，以Degree Cutoff=5，Node Score Cutoff=0.2，k-core=2，Max.Depth=100作为筛选参数，筛选关键蛋白模块，将“1.3”项下得到的交集靶点输入me
tascape 数 据 库(http://me
tascape.org/gp/index.html#/main/step1)[16]，规定物种为“H.sapiens(11)”，选择“Express Analysis”进行蛋白模块分析。
1.5 基因富集分析 将补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点利用DAVID 数 据 库[17](https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) 完成基因本体论(Gene Ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)信号通路富集分析，设定阈值P＜ 0.05，分别选取生物学过程、分子功能和细胞组成中富集基因数排名前10 的条目运用GraphPad Prism 8.0 软 件(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)进行可视化。KEGG 信号通路富集分析选择与疾病关的信号通路用Omicshare 云平台(http://omicshare.com/)进行可视化。
2 结果 Results
2.1 补肾活血汤中活性成分的筛选 通过TCMSP 及TCMID 检索到红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活、补骨脂中化合物共1 427 个，其中189 个来自红花，125 个来自当归，75 个来自肉苁蓉，226 个来自山茱萸，188 个来自枸杞子，29 个来自菟丝子，76 个来自熟地黄，119 个来自杜仲，276 个来自没药，99 个来自独活，25 个来自补骨脂。以口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18，筛选出活性化合物167个，其中22 个来自红花，2 个来自当归，6 个来自肉苁蓉，20 个来自山茱萸，45 个来自枸杞子，11 个来自菟丝子，2 个来自熟地黄，25 个来自杜仲，45 个来自没药，9 个来自独活，10 个来自补骨脂。补肾活血汤中部分活性化合物基本信息见表1。
表1 ｜补肾活血汤中部分化合物基本信息Table 1 ｜Basic information of some compounds inBushen HuoxueDecoction表注：编码为TCMSP 数据库的药效成分编码药材 编码 化学成分 口服生物利用度(%) 药物类药性红花 MOL000098 槲皮素(Quercetin) 46.43 0.28 MOL000006 木犀草素(Luteolin) 36.16 0.25 MOL000358 β-谷甾醇(Beta-sitosterol) 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚(Kaempferol) 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 43.83 0.76 MOL002776 黄芩苷(Baicalin) 40.12 0.75肉苁蓉 MOL005320 花生四烯酸(Arachidonate) 45.57 0.20 MOL005384 苏齐内酯(Suchilactone) 57.52 0.56山茱萸 MOL000359 谷甾醇(Sitosterol) 36.91 0.75 MOL000554 没食子酸-3-O-(6'-O-没食子酸)-葡萄糖苷(Gallicacid-3-O-(6'-O-galloyl)-glucoside)30.25 0.67 MOL001494 甘露醇(Mandenol) 41.99 0.19 MOL001495 亚麻酸乙酯(Ethyl linolenate) 46.10 0.20 MOL002883 Ethyl oleate (NF) 32.40 0.19 MOL005530 羟基芫花素(Hydroxygenkwanin) 36.47 0.27枸杞子 MOL001323 α1-谷甾醇(Sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL003578 环戊醇(Cycloartenol) 38.69 0.78 MOL005406 阿托品(Atropine) 45.97 0.19 MOL005438 菜油甾(固)醇(Campesterol) 37.58 0.71 MOL006209 花色素苷(Cyanin) 47.42 0.76 MOL007449 24-甲基异戊酚(24-methylidenelophenol) 44.19 0.75 MOL008173 胡萝卜素甙(Daucosterol_qt) 36.91 0.75 MOL008400 大豆黄素(Glycitein) 50.48 0.24 MOL009617 24-乙基胆甾-22-烯醇(24-ethylcholest-22-enol) 37.09 0.75 MOL009621 24-亚甲基-8-烯醇(24-methylenelanost-8-enol) 42.37 0.77菟丝子 MOL001558 芝麻素(Sesamin) 56.55 0.83 MOL005440 异岩藻甾醇(Isofucosterol) 43.78 0.76 MOL005944 苦参碱(Matrine) 63.77 0.25杜仲 MOL000073 表儿茶素(Ent-Epicatechin) 48.96 0.24 MOL000443 刺桐灵碱(Erythraline) 49.18 0.55 MOL004367 杜仲甙(Olivil) 62.23 0.41 MOL005922 五加甙B(Acanthoside B) 43.35 0.77 MOL009057 鹅掌楸甙(Liriodendrin_qt) 53.14 0.80没药 MOL000490 牵牛花色素(Petunidin) 30.05 0.31 MOL001001 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸(Quercetin-3-O-β-D-glucuronide)30.66 0.74 MOL001002 鞣花酸(Ellagic acid) 43.06 0.43 MOL001004 天竺葵素(Pelargonidin) 37.99 0.21 MOL001013 曼苏宾酸(Mansumbinoic acid) 48.10 0.32 MOL001026 没药醇C(Myrrhanol C) 39.96 0.58 MOL001027 没药A(Myrrhanone A) 40.25 0.63 MOL001029 粘液素B(Myrrhano
nes B) 34.39 0.67 MOL001031 淫羊藿醇(Epimansumbinol) 61.81 0.40 MOL001131 黄柏苷(Phellamurin_qt) 56.60 0.40独活 MOL001941 酰胺(Ammidin) 34.55 0.22 MOL001942 异欧前胡素(Isoimperatorin) 45.46 0.23补骨脂 MOL005639 补骨脂查尔酮(Bavachalcone) 44.81 0.22 MOL005009 补骨脂素(Corylifolinin) 31.04 0.27 MOL012237 胡萝卜甙(Daucosterol) 30.62 0.63 MOL005639 新补骨脂查耳酮(Neobavachalcone) 34.81 0.22 MOL001953 花椒毒素(Xanthotoxin) 35.3 0.23
2.2 补肾活血汤中交集化合物 补肾活血汤中不同的药材里面存在相同的化合物的情况，通过Venny 图求得，见图1。MOL000358-β- 谷 甾 醇、MOL000449-豆甾醇为红花、山茱萸和枸杞子所共有；MOL000098- 槲皮素为杜仲、没药、枸杞子、红花和菟丝子所共有；MOL000422-山奈酚为杜仲、菟丝子和红花所共有；MOL000448-谷甾醇为熟地黄和山茱萸所共有。
2.3 “药物-归经-活性成分-靶点”相互作用网络 根据《中华人民共和国药典》查询可知，红花归肝、心经；当归属心、肝、脾经；山茱萸归肝、肾经；枸杞子归肝、肾经；菟丝子肝、肾、脾经；熟地黄归心、肝、肾经；杜仲归肝、肾经；没药归心、肝经；独活归肾、膀胱经；补骨脂归脾、肾经；肉苁蓉归肾、大肠经。“药物-归经-活性成分-靶点”相互作用网络共包括311 个节点(11 个药物节点、6 个归经节点、142 个活性成分节点和151 个靶点节点)和1 867 条边，其中167 个活性成分中有25 个未参与网络构建，见图2。网络中的每条边代表药物所含有的活性成分以及活性成分与靶点基因之间的相互作用关系，每个节点的度值表示网络中与节点连接的路线数目。通过“Network analyze”功能对网络进行拓扑属性分析。筛选等级值(Degree)与中心度值(Betweenness Centrality，BC)较大的节点进行分析，这些节点在网络中起到了枢纽作用，可能是关键化合物或靶点。该网络中活性成分的平均度值为12.96，靶点平均度值为10.99。从活性成分方面分析，有37%的活性成分作用靶点≥12 个，通过分析活性成分-靶点的中心度值和等级值等发现，其中槲皮素、淫羊藿醇、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素及补骨脂素分别能与20 个以上的靶点蛋白发生作用。从靶点角度分析，共有39 个靶点能与10 个或10 个以上的活性成分相互作用，排名前5 位的是VEGFA，EGFR，DPP4，NOS2，PPARG，分别能与114，62，54，49，43 个活性成分相互作用。
2.4 补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点 检索GeneCards 数据库和CTD 数据库分别得到股骨头坏死相关靶点516 个和8 954 个，两者合并删除重复值共得到股骨头坏死疾病靶点8 817个。将补肾活血汤调控靶点和股骨头坏死疾病靶点两者经过Venny 在线平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析后，获得129 个交集靶点，见图3，即补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。
2.5 PPI 网络分析结果 结果显示，除IGHG1 蛋白与其他蛋白之间没有互作关系被排除，该网络包含128 个节点及1 428 条边，其中平均节点度值为22.31，见图4。以节点度值为评价参数，度值越大说明其在PPI 网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。度值排名前10 的靶点为白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子受体(EGFR)、骨桥蛋白(OPN)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)和叉头框转录因子2(Foxc2)，这些靶点可能是补肾活血汤发挥治疗股骨头坏死功效的关键靶点。
2.6 蛋白模块筛选分析结果 运用Cytoscape 3.7.2 软 件 的MCODE 插件 以Degree Cutoff=5，Node Score Cutoff=0.2，k-core=2，Max.Depth=100作为筛选参数，筛选出蛋白模块5 个，见图5。通过me
tascape 数据库分析得知，红色区蛋白模块代表肽基苏氨酸磷酸化及修饰，进行间隙链接；蓝色蛋白模块代表腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路，同时磷脂酶C 激活G蛋白偶联受体信号通路，并对类固醇激素作出反应，调节脂代谢。
2.7 GO 富集分析及KEGG 通路分析结果 通过DAVID 数据库共筛选得到 GO条 目410 个(P＜ 0.05)，其 中 生 物 过 程(Biological processes，BP)条目289 个，分子功能(Molecular function，MF)条目76 个，细胞组成(Cell composition，CC)条目45 个，分别占70%，19%，11%，其中BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、调控细胞增殖、对药物的反应、凋亡过程的负调控、G 蛋白偶联受体信号通路和管生成等；分子功能主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质均二聚活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和类固醇激素受体活性等方面；细胞组成方面主要涉及质膜、核、细胞外泌体、细胞外空间等方面。各类别前10 的条目见图6。KEGG 通路富集筛选得到110 条信号通路(P＜ 0.05)，其中排名前20 的通路绘制气泡图，见图7。补肾活血汤调控Wnt信号通路图见图8。
3 讨论 Discussion
股骨头坏死是骨科疑难病之一，其发病原因及病机尚不明确，且病程时间长，研究表明无论病因如何，该病最终会由于局部微循环障碍而导致血液循环受损，成骨细胞、骨髓组织病理性死亡[18]。中医学认为股骨头坏死属于“骨蚀”“骨痿”“骨痹”范畴，《素问·痿论》中记载“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”辨证治疗方面认为肾主骨，肾生骨髓，其充在骨，注重补肾气、益肝气、补脾活血化瘀，治疗股骨头坏死时多用补益肝肾、活血化瘀之药。补肾活血汤中补益药与活血药相配伍，既有补益肝肾，活血化瘀之效，又可免滋腻之弊。
根据网络药理学分析结果可见，补肾活血汤中关键活性成分占37%，其中槲皮素、淫羊藿醇、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素和补骨脂素能与20 个以上靶点相互作用，作用靶点最多的是槲皮素。研究证实，槲皮素可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化，具有增加成骨细胞分化的活性，还能抑制破骨细胞骨吸收和诱导破骨细胞凋亡[19]。此外，槲皮素还可以通过调节蛋白激酶、p38 及AKT 通路显著促进关节软骨细胞增殖及维持其表型[20]。在脂代谢方面，槲皮素通过降低线粒体膜电位下调PARP 和Bcl-2 的表达，进而激活Caspase-3，Bax 和Bak，诱导3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化与凋亡，同时槲皮素还是磷酸二酯酶抑制剂，能够降解脂肪细胞中的脂质，从而调节机体脂代谢[21-22]。淫羊藿醇与淫羊藿苷同属于黄酮类化合物，周爱珍等[23]通过实验研究发现淫羊藿醇提物能显著降低软骨细胞的凋亡率，同时还具有抑制软骨细胞外基质中蛋白多糖、胶原的降解，促进软骨细胞增殖等作用。研究显示，补骨脂素可能通过内皮依赖的一氧化氮途径以及调控内皮型一氧化氮合成酶蛋白的表达来发挥舒张骨内血管的作用[24]；并且通过实验证实，补骨脂素可显著促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并于浓度呈正相关关系，低浓度的补骨脂素可以抑制成骨细胞凋亡，同时可以促进细胞增殖[25]。
图 1 ｜补肾活血汤中化合物分布Figure 1 ｜Distribution of compounds inBushen HuoxueDecoction图注：紫色代表没药，海蓝色代表杜仲，橙色代表枸杞子，绿色代表红花，黄色代表山茱萸，蓝色代表肉苁蓉，粉红色代表当归，紫红色代表补骨脂
图 2 ｜“药物-归经-活性成分-靶点”网络Figure 2 ｜“Drug-meridian-active ingredient-target” network图注：分析补肾活血汤的药物、归经、活性成分及调控靶点的关联。海蓝色菱形代表补肾活血汤中的药物，蓝色六边形代表归经，红色圆形代表活性成分，黄色箭头代表靶点，每条边表示节点之间的相互作用关系
图 3 ｜补肾活血汤和股骨头坏死靶点韦恩图Figure 3 ｜Venny diagram of targets ofBushen HuoxueDecoction and osteo
necrosis of the femoral head
PPI 网络分析发现白细胞介素6、血管内皮生长因子A、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、表皮生长因子受体、骨桥蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1，8、过氧化物酶体增殖物激活受体和叉头框转录因子2 等靶点是补肾活血汤治疗股骨头坏死的主要作用靶点。其中血管内皮生长因子A 表达的多态性已被证实与股骨头坏死相关，其编码的是一种肝素结合蛋白，是血管内皮生长因子家族的重要成员。研究表明，该生长因子促进血管内皮细胞的增殖和迁移，在血管生成的生理过程中发挥重要作用，除了在血管生成中的作用外，这种生长因子也被证明对软骨内骨的形成是必不可少的[26]。肿瘤坏死因子作为一种参与全身炎症反应的细胞因子，已被证实参与了股骨头坏死的发病过程并呈现出双面性，肿瘤坏死因子仅在股骨头坏死初期升高，肿瘤坏死因子的升高可促进骨髓间充质干细胞的增殖和血管生成，同时抑制其成骨分化与Wnt 信号通路，导致成骨细胞分化减少[27]。表皮生长因子是一种强有力的有丝分裂原，其促血管生成作用已被证实。此外，不同的体外研究表明，表皮生长因子影响与骨愈合相关的过程，促进了股骨头坏死的骨形成和微血管形成[28]。WYLES 等[29]研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体调节域的破坏与股骨头坏死的风险增加有关，过氧化物酶体增殖物激活受体的异常调节会产生一种促脂肪和抑制成骨的状态。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体可以改变类固醇代谢和血管生成，这些均与股骨头坏死的发展相关。叉头框转录因子2 属于Forkhead 家族，叉头框转录因子2 在脂代谢过程中起到关键的作用，通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路并上调整合素β1 的表达，从而促使骨髓间充质干细胞及成骨前体细胞向成骨细胞分化[30]。
图4 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死靶点PPI 网络Figure 4 ｜Protein-protein interaction network of targets for treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoction图注：圆点代表蛋白，节点大小和颜色与度值呈正相关，度值越大，节点越大，颜色越深
图5 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死靶点蛋白互作模块Figure 5 ｜Protein interaction module of targets for treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoction
KEGG 通路富集结果显示，补肾活血汤治疗股骨头坏死的靶点主要涉及磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶信号通路、环磷酸腺苷信号通路、Wnt 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路以及缺氧诱导因子1 信号通路。研究发现磷酸肌醇3 激酶/蛋白激酶信号通路可以通过调控血管内皮生长因子促进血管修复再生，改善股骨头周围血供，通过调控成骨和破骨相关信号通路，加强成骨细胞分化增殖，同时抑制破骨细胞的分化增殖[31]。Wnt信号通路在骨稳态调节中起重要作用，它能够抑制骨髓间充质干细胞向软骨细胞和脂肪细胞的分化，同时促进成骨细胞的分化，该通路还控制成骨前体细胞的增殖和分化，并维持成熟的成骨细胞，据报道，Wnt 信号通路参与了股骨头坏死的早期发病，并且其通路各组成部分的突变与骨密度降低、骨折发生率增加以及其他骨骼疾病均有关[32]。丝裂原活化蛋白激酶通路家族包括细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-jun氨基末端激酶(JNK1/2)和p38 信号通路，其中，p38 丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶信号通路激活导致的细胞凋亡对股骨头坏死有重要影响。p38 通路激活后可以调节核因子κB，促进肿瘤坏死因子的表达，进而活化Caspase，促进细胞凋亡，同时还可以通过加强p66Shc 蛋白的表达影响活性氧簇在线粒体的产生，并将氧化应激信号转化成细胞凋亡信号，促进成骨细胞凋亡[33]。有研究显示，颗粒蛋白前体(PGRN)可激活股骨头坏死患者中原代软骨细胞蛋白激酶1/2 信号通路，说明在股骨头坏死的发病机制中，颗粒蛋白前体可通过激活蛋白激酶1/2 信号通路改善退变软骨细胞的合成代谢，起到调节成骨细胞分化增殖的作用[34]。根据富集结果分析，磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路富集靶点多来源于活性成分槲皮素，Wnt 信号通路富集靶点多来源于补骨脂素，而槲皮素是补肾活血汤中杜仲、没药、枸杞子、红花和菟丝子所共有成分，补骨脂素为补骨脂的主要活性成分，因此补肾活血汤中药物的活性成分可能通过调控PI3K/AKT、Wnt 信号通路来发挥治疗股骨头坏死的作用[35]。
综上所述，文章通过网络药理学方法，初步探究了补肾活血汤在治疗股骨头坏死的作用机制，可以看出补肾活血汤是通过多成分、多靶点和多途径相互协调作用来发挥疗效的，通过调节细胞代谢、增殖与凋亡、脂代谢和促进血管生成等达到治疗股骨头坏死的目的。鉴于网络药理学方法的局限性，后期还需实验方法、代谢组学及通路验证等对补肾活血汤在治疗股骨头坏死中的作用机制进一步深入分析。
图6 ｜靶点GO 富集分析Figure 6 ｜Gene o
ntology enrichment analysis of targets图注：绿色代表生物过程(Biological processes)，黄色代表分子功能(Molecular function)，红色代表细胞组成(Cell composition)，Target number 代表富集基因数，值越大说明该条目越重要
图7 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死的KEGG 通路气泡图Figure 7 ｜Bubble diagram of KEGG pathways in treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoction图注：主要涉及雌激素通路(Estrogen signaling pathway)、 磷 酸 肌 醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、环磷酸腺苷信号通路(cAMP signaling pathway)、Wnt 信号通路(Wnt signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通 路(TNF signaling pathway)、 丝 裂 原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、缺氧诱导因子1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)等与成骨成血管及骨保护相关的通路。Y轴Pathway 代表代表通路名称，X轴RichFactor 代表所占百分比，气泡面积代表通路富集基因数，气泡越大富集基因数越多，气泡颜色代表P值的大小，颜色越红代表富集程度越显著
图 8 ｜补肾活血汤调控Wnt 信号通路示意图Figure 8 ｜Schematic diagram of Wnt signal pathway regulated byBushen HuoxueDecoction图注：Wnt 信号通路的富集基因用红色星号标记显示
致谢：感谢山东中医药大学及山东中医药大学附属医院显微骨科老师们在课题研究过程中的大力支持。
作者贡献：实验设计为第一作者，资料收集由第二、三、四作者完成，文章终稿审校为通讯作者。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81774333)”及“山东省重点研发计划(2016GSF202022)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
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0 引言 Introduction股骨头坏死是骨科常见的疑难病之一，其发病原因尚不明确，可分为创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死2 大类，临床表现为髋关节疼痛、跛行及功能障碍[1]。目前，股骨头坏死的治疗主要是药物保守治疗和手术疗法。药物治疗仅局限于改善临床症状，而手术治疗一般采用髓芯减压和全髋关节置换等修复方法，存在创伤大、费用高及术后并发症多等缺陷。中医药对股骨头坏死的治疗有积极作用，尤其对于早中期患者，可延缓病程进展，有效改善患者临床症状，推迟全髋关节置换的时间[2]。中医学认为本病属于“骨蚀”“骨痹”“骨痿”范畴，致病原因以痰、瘀、虚为主，与肝、脾、肾密切相关，病机多属肝肾亏虚，气滞血瘀，治疗上多以补益肝肾，活血化瘀为主，使肝肾之气充盈，瘀血散去，经络通畅，骨得营血之濡养。补肾活血汤，出自《伤科大成》，由红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂共11 味中药组方而成，有补益肝肾、强筋壮骨、活血止痛之功效。补肾活血汤以及其化裁方在长期的临床实践中取得了较好的疗效。曾宪峰等[3]通过随机平行对照研究发现补肾活血汤可显著改善髋关节症状，疗效明显；滕佳文[4]根据临床病例观察证实补肾活血汤可明显减轻髋部疼痛，还能改善血液微循环、纠正脂质代谢紊乱；张翔等[5]实验说明补肾活血方可通过调节APNAMPK 信号通路中脂联素、肿瘤坏死因子α 的表达，对股骨头坏死发挥有效干预。网络药理学是以系统生物学为基础，对特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调药物的多分子多靶标多途径调节，提升药物疗效，降低毒副作用，从而提高新药研发效率，节省药物的研发费用[6-7]。由于补肾活血汤中药物所含化学成分多且较为复杂，并且在分子水平上治疗股骨头坏死的作用机制尚不明确，因此文章拟通过网络药理学从分子水平探究补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在活性成分及作用机制，为后期的深入研究、实验验证及新药研发提供一定的理论依据。1 资料和方法 Data and methods1.1 补肾活血汤中成分收集与筛选 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php) 和中医药综合数据库(TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，以“红花”“当归”“肉苁蓉”“山茱萸”“枸杞子”“菟丝子”“熟地黄”“杜仲”“没药”“独活”“补骨脂”为关键词检索补肾活血汤中的化学成分，其中“补骨脂”的化学成分从TCMID 中获得。口服生物利用度是ADME 中重要的药动学参数之一，它表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，口服生物利用度值越高通常表示药物的类药性越好[8-9]。因此筛选出红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂化合物中符合口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18 的化学成分作为活性成分。1.2 靶标蛋白的筛选及药物-归经-化合物-靶点网络的构建 将筛选出的补肾活血汤中的活性成分输入到TCMSP平台进行检索(其中补骨脂活性成分的靶标蛋白通过TCMID 获取)，查找出相关靶标蛋白，借助Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)查询靶标蛋白对应的基因名[10]，进行标准化处理。通过查询《中华人民共和国药典》[11]，明确补肾活血汤中各药物归经，并用Cytoscape 3.7.2 软 件(https://cytoscape.org/)，构建“药物-归经-活性成分-靶点”网络并分析。1.3 补肾活血汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测 在GeneCards Version 4.14数 据 库(https://www.genecards.org/)和CTD 毒性与基因比较数据库(http://ctdba
se.org/)中[12-13]，以“Osteo
necrosis of the femoral head”为关键词，规定物种为“Homo Sapiens”，检索与股骨头坏死相关疾病靶点。通过韦恩图将“1.2”中筛选出的药物靶点与相关疾病靶点进行映射取交集，得到补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。1.4 蛋白互作(PPI)网络构建及蛋白模块筛选与分析 将“1.3”项下得到的交集靶点导入STRING 数据库(https://string-db.org/)[14]， 选 择“Multiple Proteins” 并 将“Organism” 规 定 为“Homo sapiens”， 获 得 蛋 白 互 作关系，数据保存为TSV 格式。利用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，“Network analyzer”功能进行网络拓扑属性分析。运用Cytoscape 3.7.2 软件的MCODE 插件筛选PPI 中的蛋白模块[15]，以Degree Cutoff=5，Node Score Cutoff=0.2，k-core=2，Max.Depth=100作为筛选参数，筛选关键蛋白模块，将“1.3”项下得到的交集靶点输入me
tascape 数 据 库(http://me
tascape.org/gp/index.html#/main/step1)[16]，规定物种为“H.sapiens(11)”，选择“Express Analysis”进行蛋白模块分析。1.5 基因富集分析 将补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点利用DAVID 数 据 库[17](https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) 完成基因本体论(Gene Ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)信号通路富集分析，设定阈值P＜ 0.05，分别选取生物学过程、分子功能和细胞组成中富集基因数排名前10 的条目运用GraphPad Prism 8.0 软 件(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)进行可视化。KEGG 信号通路富集分析选择与疾病关的信号通路用Omicshare 云平台(http://omicshare.com/)进行可视化。2 结果 Results2.1 补肾活血汤中活性成分的筛选 通过TCMSP 及TCMID 检索到红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活、补骨脂中化合物共1 427 个，其中189 个来自红花，125 个来自当归，75 个来自肉苁蓉，226 个来自山茱萸，188 个来自枸杞子，29 个来自菟丝子，76 个来自熟地黄，119 个来自杜仲，276 个来自没药，99 个来自独活，25 个来自补骨脂。以口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18，筛选出活性化合物167个，其中22 个来自红花，2 个来自当归，6 个来自肉苁蓉，20 个来自山茱萸，45 个来自枸杞子，11 个来自菟丝子，2 个来自熟地黄，25 个来自杜仲，45 个来自没药，9 个来自独活，10 个来自补骨脂。补肾活血汤中部分活性化合物基本信息见表1。表1 ｜补肾活血汤中部分化合物基本信息Table 1 ｜Basic information of some compounds inBushen HuoxueDecoction表注：编码为TCMSP 数据库的药效成分编码药材 编码 化学成分 口服生物利用度(%) 药物类药性红花 MOL000098 槲皮素(Quercetin) 46.43 0.28 MOL000006 木犀草素(Luteolin) 36.16 0.25 MOL000358 β-谷甾醇(Beta-sitosterol) 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚(Kaempferol) 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 43.83 0.76 MOL002776 黄芩苷(Baicalin) 40.12 0.75肉苁蓉 MOL005320 花生四烯酸(Arachidonate) 45.57 0.20 MOL005384 苏齐内酯(Suchilactone) 57.52 0.56山茱萸 MOL000359 谷甾醇(Sitosterol) 36.91 0.75 MOL000554 没食子酸-3-O-(6'-O-没食子酸)-葡萄糖苷(Gallicacid-3-O-(6'-O-galloyl)-glucoside)30.25 0.67 MOL001494 甘露醇(Mandenol) 41.99 0.19 MOL001495 亚麻酸乙酯(Ethyl linolenate) 46.10 0.20 MOL002883 Ethyl oleate (NF) 32.40 0.19 MOL005530 羟基芫花素(Hydroxygenkwanin) 36.47 0.27枸杞子 MOL001323 α1-谷甾醇(Sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL003578 环戊醇(Cycloartenol) 38.69 0.78 MOL005406 阿托品(Atropine) 45.97 0.19 MOL005438 菜油甾(固)醇(Campesterol) 37.58 0.71 MOL006209 花色素苷(Cyanin) 47.42 0.76 MOL007449 24-甲基异戊酚(24-methylidenelophenol) 44.19 0.75 MOL008173 胡萝卜素甙(Daucosterol_qt) 36.91 0.75 MOL008400 大豆黄素(Glycitein) 50.48 0.24 MOL009617 24-乙基胆甾-22-烯醇(24-ethylcholest-22-enol) 37.09 0.75 MOL009621 24-亚甲基-8-烯醇(24-methylenelanost-8-enol) 42.37 0.77菟丝子 MOL001558 芝麻素(Sesamin) 56.55 0.83 MOL005440 异岩藻甾醇(Isofucosterol) 43.78 0.76 MOL005944 苦参碱(Matrine) 63.77 0.25杜仲 MOL000073 表儿茶素(Ent-Epicatechin) 48.96 0.24 MOL000443 刺桐灵碱(Erythraline) 49.18 0.55 MOL004367 杜仲甙(Olivil) 62.23 0.41 MOL005922 五加甙B(Acanthoside B) 43.35 0.77 MOL009057 鹅掌楸甙(Liriodendrin_qt) 53.14 0.80没药 MOL000490 牵牛花色素(Petunidin) 30.05 0.31 MOL001001 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸(Quercetin-3-O-β-D-glucuronide)30.66 0.74 MOL001002 鞣花酸(Ellagic acid) 43.06 0.43 MOL001004 天竺葵素(Pelargonidin) 37.99 0.21 MOL001013 曼苏宾酸(Mansumbinoic acid) 48.10 0.32 MOL001026 没药醇C(Myrrhanol C) 39.96 0.58 MOL001027 没药A(Myrrhanone A) 40.25 0.63 MOL001029 粘液素B(Myrrhano
nes B) 34.39 0.67 MOL001031 淫羊藿醇(Epimansumbinol) 61.81 0.40 MOL001131 黄柏苷(Phellamurin_qt) 56.60 0.40独活 MOL001941 酰胺(Ammidin) 34.55 0.22 MOL001942 异欧前胡素(Isoimperatorin) 45.46 0.23补骨脂 MOL005639 补骨脂查尔酮(Bavachalcone) 44.81 0.22 MOL005009 补骨脂素(Corylifolinin) 31.04 0.27 MOL012237 胡萝卜甙(Daucosterol) 30.62 0.63 MOL005639 新补骨脂查耳酮(Neobavachalcone) 34.81 0.22 MOL001953 花椒毒素(Xanthotoxin) 35.3 0.232.2 补肾活血汤中交集化合物 补肾活血汤中不同的药材里面存在相同的化合物的情况，通过Venny 图求得，见图1。MOL000358-β- 谷 甾 醇、MOL000449-豆甾醇为红花、山茱萸和枸杞子所共有；MOL000098- 槲皮素为杜仲、没药、枸杞子、红花和菟丝子所共有；MOL000422-山奈酚为杜仲、菟丝子和红花所共有；MOL000448-谷甾醇为熟地黄和山茱萸所共有。2.3 “药物-归经-活性成分-靶点”相互作用网络 根据《中华人民共和国药典》查询可知，红花归肝、心经；当归属心、肝、脾经；山茱萸归肝、肾经；枸杞子归肝、肾经；菟丝子肝、肾、脾经；熟地黄归心、肝、肾经；杜仲归肝、肾经；没药归心、肝经；独活归肾、膀胱经；补骨脂归脾、肾经；肉苁蓉归肾、大肠经。“药物-归经-活性成分-靶点”相互作用网络共包括311 个节点(11 个药物节点、6 个归经节点、142 个活性成分节点和151 个靶点节点)和1 867 条边，其中167 个活性成分中有25 个未参与网络构建，见图2。网络中的每条边代表药物所含有的活性成分以及活性成分与靶点基因之间的相互作用关系，每个节点的度值表示网络中与节点连接的路线数目。通过“Network analyze”功能对网络进行拓扑属性分析。筛选等级值(Degree)与中心度值(Betweenness Centrality，BC)较大的节点进行分析，这些节点在网络中起到了枢纽作用，可能是关键化合物或靶点。该网络中活性成分的平均度值为12.96，靶点平均度值为10.99。从活性成分方面分析，有37%的活性成分作用靶点≥12 个，通过分析活性成分-靶点的中心度值和等级值等发现，其中槲皮素、淫羊藿醇、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素及补骨脂素分别能与20 个以上的靶点蛋白发生作用。从靶点角度分析，共有39 个靶点能与10 个或10 个以上的活性成分相互作用，排名前5 位的是VEGFA，EGFR，DPP4，NOS2，PPARG，分别能与114，62，54，49，43 个活性成分相互作用。2.4 补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点 检索GeneCards 数据库和CTD 数据库分别得到股骨头坏死相关靶点516 个和8 954 个，两者合并删除重复值共得到股骨头坏死疾病靶点8 817个。将补肾活血汤调控靶点和股骨头坏死疾病靶点两者经过Venny 在线平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析后，获得129 个交集靶点，见图3，即补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。2.5 PPI 网络分析结果 结果显示，除IGHG1 蛋白与其他蛋白之间没有互作关系被排除，该网络包含128 个节点及1 428 条边，其中平均节点度值为22.31，见图4。以节点度值为评价参数，度值越大说明其在PPI 网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。度值排名前10 的靶点为白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子受体(EGFR)、骨桥蛋白(OPN)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)和叉头框转录因子2(Foxc2)，这些靶点可能是补肾活血汤发挥治疗股骨头坏死功效的关键靶点。2.6 蛋白模块筛选分析结果 运用Cytoscape 3.7.2 软 件 的MCODE 插件 以Degree Cutoff=5，Node Score Cutoff=0.2，k-core=2，Max.Depth=100作为筛选参数，筛选出蛋白模块5 个，见图5。通过me
tascape 数据库分析得知，红色区蛋白模块代表肽基苏氨酸磷酸化及修饰，进行间隙链接；蓝色蛋白模块代表腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路，同时磷脂酶C 激活G蛋白偶联受体信号通路，并对类固醇激素作出反应，调节脂代谢。2.7 GO 富集分析及KEGG 通路分析结果 通过DAVID 数据库共筛选得到 GO条 目410 个(P＜ 0.05)，其 中 生 物 过 程(Biological processes，BP)条目289 个，分子功能(Molecular function，MF)条目76 个，细胞组成(Cell composition，CC)条目45 个，分别占70%，19%，11%，其中BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、调控细胞增殖、对药物的反应、凋亡过程的负调控、G 蛋白偶联受体信号通路和管生成等；分子功能主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质均二聚活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和类固醇激素受体活性等方面；细胞组成方面主要涉及质膜、核、细胞外泌体、细胞外空间等方面。各类别前10 的条目见图6。KEGG 通路富集筛选得到110 条信号通路(P＜ 0.05)，其中排名前20 的通路绘制气泡图，见图7。补肾活血汤调控Wnt信号通路图见图8。3 讨论 Discussion股骨头坏死是骨科疑难病之一，其发病原因及病机尚不明确，且病程时间长，研究表明无论病因如何，该病最终会由于局部微循环障碍而导致血液循环受损，成骨细胞、骨髓组织病理性死亡[18]。中医学认为股骨头坏死属于“骨蚀”“骨痿”“骨痹”范畴，《素问·痿论》中记载“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”辨证治疗方面认为肾主骨，肾生骨髓，其充在骨，注重补肾气、益肝气、补脾活血化瘀，治疗股骨头坏死时多用补益肝肾、活血化瘀之药。补肾活血汤中补益药与活血药相配伍，既有补益肝肾，活血化瘀之效，又可免滋腻之弊。根据网络药理学分析结果可见，补肾活血汤中关键活性成分占37%，其中槲皮素、淫羊藿醇、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素和补骨脂素能与20 个以上靶点相互作用，作用靶点最多的是槲皮素。研究证实，槲皮素可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化，具有增加成骨细胞分化的活性，还能抑制破骨细胞骨吸收和诱导破骨细胞凋亡[19]。此外，槲皮素还可以通过调节蛋白激酶、p38 及AKT 通路显著促进关节软骨细胞增殖及维持其表型[20]。在脂代谢方面，槲皮素通过降低线粒体膜电位下调PARP 和Bcl-2 的表达，进而激活Caspase-3，Bax 和Bak，诱导3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化与凋亡，同时槲皮素还是磷酸二酯酶抑制剂，能够降解脂肪细胞中的脂质，从而调节机体脂代谢[21-22]。淫羊藿醇与淫羊藿苷同属于黄酮类化合物，周爱珍等[23]通过实验研究发现淫羊藿醇提物能显著降低软骨细胞的凋亡率，同时还具有抑制软骨细胞外基质中蛋白多糖、胶原的降解，促进软骨细胞增殖等作用。研究显示，补骨脂素可能通过内皮依赖的一氧化氮途径以及调控内皮型一氧化氮合成酶蛋白的表达来发挥舒张骨内血管的作用[24]；并且通过实验证实，补骨脂素可显著促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并于浓度呈正相关关系，低浓度的补骨脂素可以抑制成骨细胞凋亡，同时可以促进细胞增殖[25]。图 1 ｜补肾活血汤中化合物分布Figure 1 ｜Distribution of compounds inBushen HuoxueDecoction图注：紫色代表没药，海蓝色代表杜仲，橙色代表枸杞子，绿色代表红花，黄色代表山茱萸，蓝色代表肉苁蓉，粉红色代表当归，紫红色代表补骨脂图 2 ｜“药物-归经-活性成分-靶点”网络Figure 2 ｜“Drug-meridian-active ingredient-target” network图注：分析补肾活血汤的药物、归经、活性成分及调控靶点的关联。海蓝色菱形代表补肾活血汤中的药物，蓝色六边形代表归经，红色圆形代表活性成分，黄色箭头代表靶点，每条边表示节点之间的相互作用关系图 3 ｜补肾活血汤和股骨头坏死靶点韦恩图Figure 3 ｜Venny diagram of targets ofBushen HuoxueDecoction and osteo
necrosis of the femoral headPPI 网络分析发现白细胞介素6、血管内皮生长因子A、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、表皮生长因子受体、骨桥蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1，8、过氧化物酶体增殖物激活受体和叉头框转录因子2 等靶点是补肾活血汤治疗股骨头坏死的主要作用靶点。其中血管内皮生长因子A 表达的多态性已被证实与股骨头坏死相关，其编码的是一种肝素结合蛋白，是血管内皮生长因子家族的重要成员。研究表明，该生长因子促进血管内皮细胞的增殖和迁移，在血管生成的生理过程中发挥重要作用，除了在血管生成中的作用外，这种生长因子也被证明对软骨内骨的形成是必不可少的[26]。肿瘤坏死因子作为一种参与全身炎症反应的细胞因子，已被证实参与了股骨头坏死的发病过程并呈现出双面性，肿瘤坏死因子仅在股骨头坏死初期升高，肿瘤坏死因子的升高可促进骨髓间充质干细胞的增殖和血管生成，同时抑制其成骨分化与Wnt 信号通路，导致成骨细胞分化减少[27]。表皮生长因子是一种强有力的有丝分裂原，其促血管生成作用已被证实。此外，不同的体外研究表明，表皮生长因子影响与骨愈合相关的过程，促进了股骨头坏死的骨形成和微血管形成[28]。WYLES 等[29]研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体调节域的破坏与股骨头坏死的风险增加有关，过氧化物酶体增殖物激活受体的异常调节会产生一种促脂肪和抑制成骨的状态。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体可以改变类固醇代谢和血管生成，这些均与股骨头坏死的发展相关。叉头框转录因子2 属于Forkhead 家族，叉头框转录因子2 在脂代谢过程中起到关键的作用，通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路并上调整合素β1 的表达，从而促使骨髓间充质干细胞及成骨前体细胞向成骨细胞分化[30]。图4 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死靶点PPI 网络Figure 4 ｜Protein-protein interaction network of targets for treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoction图注：圆点代表蛋白，节点大小和颜色与度值呈正相关，度值越大，节点越大，颜色越深图5 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死靶点蛋白互作模块Figure 5 ｜Protein interaction module of targets for treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoctio
nKEGG 通路富集结果显示，补肾活血汤治疗股骨头坏死的靶点主要涉及磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶信号通路、环磷酸腺苷信号通路、Wnt 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路以及缺氧诱导因子1 信号通路。研究发现磷酸肌醇3 激酶/蛋白激酶信号通路可以通过调控血管内皮生长因子促进血管修复再生，改善股骨头周围血供，通过调控成骨和破骨相关信号通路，加强成骨细胞分化增殖，同时抑制破骨细胞的分化增殖[31]。Wnt信号通路在骨稳态调节中起重要作用，它能够抑制骨髓间充质干细胞向软骨细胞和脂肪细胞的分化，同时促进成骨细胞的分化，该通路还控制成骨前体细胞的增殖和分化，并维持成熟的成骨细胞，据报道，Wnt 信号通路参与了股骨头坏死的早期发病，并且其通路各组成部分的突变与骨密度降低、骨折发生率增加以及其他骨骼疾病均有关[32]。丝裂原活化蛋白激酶通路家族包括细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-jun氨基末端激酶(JNK1/2)和p38 信号通路，其中，p38 丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶信号通路激活导致的细胞凋亡对股骨头坏死有重要影响。p38 通路激活后可以调节核因子κB，促进肿瘤坏死因子的表达，进而活化Caspase，促进细胞凋亡，同时还可以通过加强p66Shc 蛋白的表达影响活性氧簇在线粒体的产生，并将氧化应激信号转化成细胞凋亡信号，促进成骨细胞凋亡[33]。有研究显示，颗粒蛋白前体(PGRN)可激活股骨头坏死患者中原代软骨细胞蛋白激酶1/2 信号通路，说明在股骨头坏死的发病机制中，颗粒蛋白前体可通过激活蛋白激酶1/2 信号通路改善退变软骨细胞的合成代谢，起到调节成骨细胞分化增殖的作用[34]。根据富集结果分析，磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路富集靶点多来源于活性成分槲皮素，Wnt 信号通路富集靶点多来源于补骨脂素，而槲皮素是补肾活血汤中杜仲、没药、枸杞子、红花和菟丝子所共有成分，补骨脂素为补骨脂的主要活性成分，因此补肾活血汤中药物的活性成分可能通过调控PI3K/AKT、Wnt 信号通路来发挥治疗股骨头坏死的作用[35]。综上所述，文章通过网络药理学方法，初步探究了补肾活血汤在治疗股骨头坏死的作用机制，可以看出补肾活血汤是通过多成分、多靶点和多途径相互协调作用来发挥疗效的，通过调节细胞代谢、增殖与凋亡、脂代谢和促进血管生成等达到治疗股骨头坏死的目的。鉴于网络药理学方法的局限性，后期还需实验方法、代谢组学及通路验证等对补肾活血汤在治疗股骨头坏死中的作用机制进一步深入分析。图6 ｜靶点GO 富集分析Figure 6 ｜Gene o
ntology enrichment analysis of targets图注：绿色代表生物过程(Biological processes)，黄色代表分子功能(Molecular function)，红色代表细胞组成(Cell composition)，Target number 代表富集基因数，值越大说明该条目越重要图7 ｜补肾活血汤治疗股骨头坏死的KEGG 通路气泡图Figure 7 ｜Bubble diagram of KEGG pathways in treating osteo
necrosis of the femoral head withBushen HuoxueDecoction图注：主要涉及雌激素通路(Estrogen signaling pathway)、 磷 酸 肌 醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、环磷酸腺苷信号通路(cAMP signaling pathway)、Wnt 信号通路(Wnt signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通 路(TNF signaling pathway)、 丝 裂 原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、缺氧诱导因子1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)等与成骨成血管及骨保护相关的通路。Y轴Pathway 代表代表通路名称，X轴RichFactor 代表所占百分比，气泡面积代表通路富集基因数，气泡越大富集基因数越多，气泡颜色代表P值的大小，颜色越红代表富集程度越显著图 8 ｜补肾活血汤调控Wnt 信号通路示意图Figure 8 ｜Schematic diagram of Wnt signal pathway regulated byBushen HuoxueDecoction图注：Wnt 信号通路的富集基因用红色星号标记显示致谢：感谢山东中医药大学及山东中医药大学附属医院显微骨科老师们在课题研究过程中的大力支持。作者贡献：实验设计为第一作者，资料收集由第二、三、四作者完成，文章终稿审校为通讯作者。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81774333)”及“山东省重点研发计划(2016GSF202022)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] 虹霖,侯德才,魏波,等.基于筋骨并重理论中医内治法联合髓芯减压+人工骨植骨术治疗股骨头缺血性坏死[J].长春中医药大学学报,2020,36(2):402-405.[2] 李盛华,邓昶,周明旺,等.中医药防治股骨头坏死临床应用现状[J].中国中医药信息杂志,2018,25(6):137-140.[3] 曾宪峰,王进东,梁鼎天,等.补肾活血汤联合西医治疗早中期非创伤性股骨头缺血坏死(肾虚血瘀)随机平行对照研究[J].实用中医内科杂志,2019,33(5):38-41.[4] 滕加文.补肾活血汤治疗股骨头缺血性坏死45 例[J].山东中医药大学学报,2011,35(1):36-37.[5] 张翔,吴泱,董晓俊,等.补肾活血方调控兔激素性股骨头坏死APN-AMPK 信号通路的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2019,39(10):1234-1239.[6] LIU JF, HU AN, ZAN JF, et al. Network pharmacology deciphering mechanisms of volatiles of granule for the treatment of Alzheimer’s disease. Evid ba
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