0 引言 Introduction
股骨头坏死是股骨头血供中断或受损，引起骨细胞、骨髓成分死亡及骨组织异常修复，继而导致股骨头结构改变，股骨头塌陷，引起患者关节疼痛，功能障碍的疾病，是骨科常见的难治性疾病[1]。据流行病学调查研究显示，中国目前约有800 万例股骨头坏死患者，且每年有(10-20)万例的新发病例[2]。相当一部分股骨头坏死患者是年轻人(20-40 岁)，这类患者髋关节置换后假体的使用寿命并不理想，面临多次翻修手术的风险；此外，部分老年患者因存在慢性基础性疾病，并不适合手术，保髋治疗是更好的选择。
近年来，经过大量临床观察及动物实验证实，中医药在治疗股骨头坏死方面具有显著疗效，不仅可以改善坏死状态，而且能修复坏死的骨组织[3]。中医治疗股骨头坏死的研究发现患者病机因多属血瘀痰阻、经络阻滞兼有肝肾亏虚、气血不足，与中华中医药学会发布《股骨头坏死中医辨证标准》相符[4]。圣愈汤载于朱震亨《脉因证治·金疮》，由人参、黄芪、熟地、当归、白芍和川芎6 味药组成，具有益气补血、活血化瘀的功效。施杞教授创立“调和气血法”，总结出以圣愈汤为基础的治疗股骨头坏死方剂，将益气养血、行气活血贯穿于治疗股骨头坏死过程的始终[5]。刘粉叶等[6]发现圣愈汤能通过促进骨髓造血细胞增殖，其机制与促进造血生长因子的合成和分泌，与中医益气活血理论相符。由于圣愈汤所含化学成分较为复杂，其治疗股骨头坏死的机制尚不明确。
因此，文章旨在通过网络药理学方法，挖掘圣愈汤入血活性成分、作用靶点与股骨头坏死作用靶点关系网络，分析其潜在作用机制。
1.1.2 检索时间及地点 于2020 年4月至5 月在广西中医药大学附属瑞康医院完成。
1.1.3 检索数据库 见表1。
1.2 圣愈汤活性成分筛选和靶点预测运用TCMSP 中检索圣愈汤的6 味中药为人参(脾经、肺经、心经、肾经)、黄芪(归肺经、脾经)、熟地(肺经、肾经)、当归(心经、肝经、脾经)、白芍(胃经、肾经)和川芎(肝经、胆经)。以上中药归经信息均参考自中医药百科全书(Encyclopaedia of Traditio
nal Chinese Medicin，ETCM)[7]。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 软件与数据库
1.1.1 检索人 第一作者进行检索，通讯作者核对。
根据数据库建议参考标准：生物口服利用度(oral bioavailability，OB) ≥30% 和 类 药 性(drug likeness，DL)≥0.18 作为筛选标准，确定圣愈汤中所含中药活性成分的集合。基于TCMSP 数据库查询每个活性成分对应的靶蛋白，基于TCMSP 数据库，将获得的活性成分逐一配对潜在作用靶点，再通过Uniprot 数据库进行靶点蛋白和基因信息校正，筛选出圣愈汤主要活性成分的作用靶点。
表1 ｜检索的软件与数据库Table 1 ｜Software and databa
ses used for data retrival序号 名称 网址 版本1 中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php 2.3 2 UniProt 数据库 https://www.uniprot.org 更新于2020-05-05 3 Gene ex
pression Omnibus数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo 更新于2020-05-05 4 Venny 软件 http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html 2.1.0 5 Cytoscape 软件 http://www.cytoscape.org/ 3.7.2 6 STRING 数据库 http://string-db.org/cgi/input.pl 11.0 7 DAVID 数据库 http://david.ncifcrf.gov. 6.8 8 R 语言软件 http://www.r-project.org/ 3.6.2 9 PDB 数据库 http://www.rcsb.org/ 更新于2020-05-05 10 Pubchem 数据库 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 更新于2020-05-05 11 PyMOL 软件 https://pymol.org/2/ 1.7.2.1 12 AutoDuckTools 软件 http://autodock.scripps.edu/resources/adt 1.5.6 13 Autodock vina 软件 http://vina.scripps.edu 1.1.2
1.3 股骨头坏死靶点预测 以“Osteo
necrosis of the femoral head”为关键词在GeneCards、以及OMIM数据库中查找与股骨头坏死相关靶点。再从Gene ex
pression Omnibus 数据库下载编号为：GSE74089 的芯片数据原始文件[8]，此芯片收集4 例股骨头坏死患者和4 名健康对照者髋关节软骨标本的基因测序信息，利用R 语言软件中的limma 包分析芯片数据的差异基因，设置差异倍数(Fold change，FC) ＞ 0.5，显著差异基因的筛选条件为P＜ 0.05；最后运用pheatmap 包对差异基因绘制差异基因热图和火山图，同时保存股骨头坏死患者和健康对照之间的差异基因。采用两独立样本t检验检测组间数据差异，用FDR 错误控制法对P值作多重假设检验校正。将差异分析得到的基因与GeneCards 和OMIM 数据库的查找结果合并，删除重复靶点保留惟一项，所得靶点即为股骨头坏死的相关靶点。
1.4 圣愈汤治疗股骨头坏死共同靶点筛选 将圣愈汤活性成分靶点和股骨头坏死相关靶点经Venny 2.1.0 软件取交集，获得圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点。
1.5 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络及分析 使用可视化网络构建与分析软件Cytoscape 3.7.2，根据得到的圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点，整合对应有效成分导入，建立“活性成分-靶点”网络，同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络。同时利用插件Cyto
nCA 计算网络节点的自由度(Degree)，Degree 大小与相关节点数量呈正比，据此筛选出靶点数目较多的活性成分。
1.6 构建共同靶点的蛋白互作网络 将上述共同靶点导入STRING 数据库，选择物种为人，以最低要求互动得分(minimum required interaction score)0.7为筛选参数，得到圣愈汤治疗股骨头坏死的PPI 网络，在构建的PPI 网络中，节点的大小和颜色深浅反映自由度(Degree)值大小，边粗细反映组合分数(combine score)大小。导出“TSV”文件并运用Cytoscape 3.7.2 软件中Network Analyzer 工具分析网络中节点的度值，根据度值的排序确定核心靶点。
1.7 GO 富集分析与KEGG 富集分析利用DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov，Version 6.8)对潜在靶点进行GO功能富集分析，研究圣愈汤治疗股骨头坏死生物功能；KEGG 富集分析潜在靶点的相关通路，研究圣愈汤治疗股骨头坏死的主要信号通路，P＜ 0.01 代表富集结果显著。最后利用R 语言绘制GO富集分析图及KEGG 富集分析气泡图。
1.8 分子对接验证 采用Autodock vina分子对接软件来验证网络药理学筛选结果。在上述步骤结果基础上，选择靶点数目较多的活性成分作为配体和PPI 网络关系图中度值排名前5 的靶蛋白作为受体进行分子对接。从PDB 数据库中查询以上靶蛋白的3D 结构。用PyMOL 1.7.2.1 软件进行预处理，移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)。从PubChem 数据库下载筛选出关键化合物结构，并基于MMFF94 力场对化合物的结构进行优化。使用AutodockTools软件对化合物进行可旋转键的搜寻与定义[9]；对DPE 蛋白结构通过多肽链缺失残基和末端残基修补、除去水分子、添加氢原子、添加电荷，并保存为PDBQT格式。以原配体所在位点为靶蛋白的活性口袋，分别进行靶蛋白与活性化合物的分子对接。如蛋白没有原配体，则以蛋白和dna 相互作用的残基构建活性口袋进行对接。得出结合自由能(ΔGbind，kJ/mol)，根据文献报道[10]，这里选取结合能≤-5.0 k J/mol 的活性成分作为验证“成分-靶点”的筛选依据。选取“1.5”项中度值最高化合物和“1.6”项度值最高靶点对接结合构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol 进行作图。
1.9 主要观察指标 主要观察关键基因在KEGG 和GO 富集结果，关键基因与关键化合物分子对接结果。
2 结果 Results
2.1 活性化合物的筛选结果 通过TCMSP 数据库检索共收集得到圣愈汤的化学成分752 个，其中黄芪87 个，人 参190 个， 白 芍85 个， 熟 地76个，当归125 个，川芎189 个，再以OB ≥30%和DL ≥0.18 为活性成分筛选条件对752 个成分进行筛选，得到复方中共66 个活性化学成分，黄芪、人参、芍药、熟地、当归和川芎的活性成分分别为20，22，13，2，2 和7 个，其中白芍和黄芪有1 个交集化合物，白芍、黄芪和人参有1 个交集化合物，川芎和黄芪有1 个交集化合物，当归、白芍和人参有1 个交集化合物，熟地、当归和人参有1 个交集化合物，主要活性成分的基本信息见表2。
2.2 股骨头坏死相关靶点筛选结果 根据筛选条件，对GEO 芯片数据库的基因芯片的二次分析获得5 443 个差异表达基因，运用R 语言软件绘制股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的火山图和股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的聚类图见图1。这些基因可能与股骨头坏死的发生发展密切相关；通过GeneCards和OMIM 数据库收集对股骨头坏死有意义的靶点736 个；删除重复项后纳入6 045 个候选基因。
表2 ｜圣愈汤中潜在活性成分基本信息Table 2 ｜Basic information of potential active compo
nents inShengyuDecoction编号 ID 化学成分 生物口服利用度(%)类药性 来源64.77 0.38 白芍2 MOL001918 芍药苷元(paeoniflorgenone) 87.59 0.37 白芍3 MOL001919 (3S，5R，8R，9R，10S，14S)-3，17-dihydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-2，3，5，6，7，9-hexahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthrene-15，16-dione 1 MOL001910 11alpha，12alpha-epoxy-3beta-23-dihydroxy-30-norolean-20-en-28，12beta-olide 43.56 0.53 白芍4 MOL001921 芍药新苷(Lactiflorin) 49.12 0.80 白芍5 MOL001924 芍药苷(paeoniflorin) 53.87 0.79 白芍6 MOL001925 芍药苷_qt(paeoniflorin_qt) 68.18 0.40 白芍7 MOL001928 芍药内酯苷_qt(albiflorin_qt) 66.64 0.33 白芍8 MOL001930 苯甲酰芍药甙(benzoyl paeoniflorin) 31.27 0.75 白芍9 MOL000211 丁子香萜(Mairin) 55.38 0.78 白芍、黄芪10 MOL000422 山奈酚(kaempferol) 41.88 0.24 白芍、黄芪、人参11 MOL000492 (+)-儿茶素((+)-catechin) 54.83 0.24 白芍12 MOL001494 亚油酸乙酯(Mandenol) 42.00 0.19 川芎13 MOL002135 MYRICANONE(Myricanone) 40.60 0.51 川芎14 MOL002140 川芎哚(Perlolyrine) 65.95 0.27 川芎15 MOL002151 洋川芎醌(senkyunone) 47.66 0.24 川芎16 MOL002157 萘呋内酯(wallichilide) 42.31 0.71 川芎17 MOL000359 谷甾醇(sitosterol) 36.91 0.75 熟地、川芎、白芍18 MOL000433 FA 68.96 0.71 川芎、黄芪19 MOL000358 β 谷甾醇(beta-sitosterol) 36.91 0.75 当归、白芍、人参20 MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 43.83 0.76 熟地、当归、人参21 MOL000239 熊竹素(Jaranol) 50.83 0.29 黄芪22 MOL000296 三萜皂苷(hederagenin) 36.91 0.75 黄芪23 MOL000033 (3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-dimethyl-36.23 0.78 黄芪17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol 24 MOL000354 异鼠李素(isorhamnetin) 49.6 0.31 黄芪25 MOL000371 3，9-di-O-methylnissolin 53.74 0.48 黄芪26 MOL000374 5'-hydroxyiso-muronulatol-2'，5'-di-O-glucoside 41.72 0.69 黄芪27 MOL000378 7-O-methylisomucro
nulatol 74.69 0.3 黄芪28 MOL000379 9，10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside 36.74 0.92 黄芪29 MOL000380 (6aR，11aR)-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6Hbenzofurano[3，2-c]chromen-3-ol 64.26 0.42 黄芪30 MOL000387 联苯双酯(Bifendate) 31.10 0.67 黄芪31 MOL000392 芒柄花黄素(formononetin) 69.67 0.21 黄芪32 MOL000398 异黄烷酮(isoflavanone) 109.99 0.30 黄芪33 MOL000417 毛蕊异黄酮(Calycosin) 47.75 0.24 黄芪34 MOL000438 (3R)-3-(2-hydroxy-3，4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 67.67 0.26 黄芪35 MOL000439 (isomucronulatol-7，2'-di-O-glucosiole) 49.28 0.62 黄芪36 MOL000442 1，7-Dihydroxy-3，9-dimethoxy pterocarpene 39.05 0.48 黄芪37 MOL000098 槲皮素(quercetin) 46.43 0.28 黄芪38 MOL002879 酞酸酯(Diop) 43.59 0.39 人参39 MOL003648 朝鲜槐英(Inermin) 65.83 0.54 人参40 MOL004492 菊黄质(Chrysanthemaxanthin) 38.72 0.58 人参41 MOL005308 阿朴天仙子碱(Aposiopolamine) 66.65 0.22 人参42 MOL005314 南蛇藤苄酰胺(Celabenzine) 101.88 0.49 人参43 MOL005317 脱氧三尖杉酯碱(Deoxyharringtonine) 39.27 0.81 人参44 MOL005318 石竹胺(Dianthramine) 40.45 0.20 人参45 MOL005320 花生四烯酸(arachidonate) 45.57 0.20 人参46 MOL005321 紫穗槐酮甲(Frutinone A) 65.90 0.34 人参47 MOL005344 人参皂苷 rh2(ginsenoside rh2) 36.32 0.56 人参48 MOL005348 人参皂苷 Rh4_qt(Ginsenoside Rh4_qt) 31.11 0.78 人参49 MOL005356 吉九里香碱(Girinimbine) 61.22 0.31 人参50 MOL005357 五味子酯乙(Gomisin B) 31.99 0.83 人参51 MOL005360 马尔肯久纳醇苯酯(malkangunin) 57.71 0.63 人参52 MOL005376 人参二醇(Panaxadiol) 33.09 0.79 人参53 MOL005384 苏齐内酯(suchilactone) 57.52 0.56 人参54 MOL005399 胡萝卜甙_qt(alexandrin_qt) 36.91 0.75 人参55 MOL005401 人参皂苷 Rg5_qt(ginsenoside Rg5_qt) 39.56 0.79 人参56 MOL000787 蓝堇碱 (Fumarine) 59.26 0.83 人参
2.3 圣愈汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测结果 在TCMSP 数据库得到的圣愈汤中活性成分靶点196 个；GEO 差异分析、GeneCards 和OMIM 数据库中获得股骨头坏死的相关靶点6 045 个，通过Venny 平台取交集后显示，圣愈汤与股骨头坏死药物-疾病交集靶基因共73 个，见图2。
2.4 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络 运用Cytoscape 软件构建“活性成分-靶点”网络，见图3，共包括100 个节点(27 个活性成分节点和73 个靶点节点)和182 条边。同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”，见图4。使用Network analyze 功能对网络进行拓扑属性分析，其中度值是衡量1 个节点在网络中关键性的重要参数。该网络中度值排名前5 位的化合物分别是山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆 甾 醇(Stigmasterol)和异鼠李素(isorhamnetin)、分别能与65，45，43，14，10 个靶点连接，对治疗股骨头坏死具有重要的意义，其基本信息见表3。
2.5 PPI 网络及网络拓扑分析结果 通过STRING 数据库以最低要求互动得分(minimum required interaction score) 为0.7 为筛选参数分析共得到233 对蛋白互作关系，涉及73 个蛋白靶点。采用Cytoscape 软件构建蛋白互作网络，见图5。
文章通过Network Analyzer 工具分析网络中节点的度值，将度值≥8(均值)的靶点由高到低排序，见图6。度值排名前5 的蛋白基因是炎性细胞因子白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、原癌基因蛋白(Proto-o
ncogene proteins，JUN)、 基 质金属肽酶9(Matrix me
talloproteinase-9，MMP9)及炎性细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1 beta，IL-1β)。这些蛋白在整个网络中起着关键的作用，蛋白所对应的靶点在圣愈汤治疗治疗股骨头坏死中具有重要作用，认为是圣愈汤治疗股骨头坏死的关键靶点。
2.6 GO 富集分析结果 GO 富集分析得到GO 条目共804 个(P＜ 0.01)，其中生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)条目分别为732，23，49 个。
从生物过程的相关条目分析，圣愈汤治疗股骨头坏死的靶点主要参与对炎 症 反 应(Inflammatory reaction)、氧 化应激反应(respo
nse to oxidative stress)和血管生成调节(regulation of angiogenesis)等过程；从细胞组成的相关条目分析，治疗靶点主要包括转录因子复合体(trans
cription factor complex)、内质网腔(intrinsic compo
nent of postsynaptic) 及核染色质(RNA polymerase II trans
cription factor)等区域；从分子功能的相关条目分子，治疗靶点主要与丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、调 节 核 受 体活性(nuclear receptor activity)和蛋白酶结合(protease binding)等方面相关。根据P值排序，每个模块前20 位的条目见图7。
2.7 KEGG 富集分析结果 KEGG 通路富集分析共得到120 条通路，根据P值排序，列出前20 位条目，见图8。主要涉及缺氧诱导因子1α 信号通路、白细胞介素17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子B 信号通路和Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路等，这些通路与炎症反应、骨代谢、血管生成和免疫调节密切相关。
2.8 分子对接验证 将“2.4”项筛选出的关键化合物和“2.5”项的关键靶蛋白进行分子对接验证。分子对接结果显示圣愈汤关键活性化合物与靶蛋白的分子对接亲和力均远小于-5.0 kJ/mol，结果表明圣愈汤中关键化合物与关键靶蛋白有较好的结合活性，结果见表4。山奈酚为预测靶点最多的活性成分，白细胞介素6 为PPI 网络中degree 值最大的靶点，以山奈酚和白细胞介素6 蛋白结构对接模式为例，结果显示山柰酚能稳定地对接到白细胞介素6 蛋白结构的活性口袋中，见图9；山奈酚与白细胞介素6 蛋白结合关键疏水氨基酸残基是ASP-1042，ARG-01041，GLY-1097，GLN-1098，THR-1100，PHE-1046，MET-1085，VAL-1045 和HIS-1096。
表3 ｜关键化合物的基本信息Table 3 ｜The basic information on the key compoundsMOLID 化学成分 度值 来源 结构MOL000422 山柰酚(kaempferol) 65 白芍、黄芪、人参MOL000098 槲皮素(quercetin) 45 黄芪MOL000358 β-谷甾醇(beta-sitosterol) 43 白芍、当归MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 14 当归、人参、熟地MOL000354 异鼠李素(isorhamnetin) 10 黄芪
表4 ｜关键化合物与核心靶点的结合能 (kJ/mol)Table 4 ｜The binding energy values of the core compounds异鼠李素(isorhamnetin)白细胞介素6 -30.124 8 -36.801 6 -24.255 6 -28.855 8 -37.219 8血管内皮生长因子A -28.019 4 -28.855 8 -27.601 2 -30.110 4 -27.183 JUN -39.729 -39.310 8 -35.965 2 -34.292 4 -38.474 4基质金属蛋白酶9 -23.419 2 -22.582 8 -13.800 6 -20.91 -21.328 2白细胞介素1β -30.526 8 -30.114 -29.274 1 -28.019 4 -30.110 4基因 山柰酚(kaempferol)槲皮素(quercetin)β-谷甾醇(beta-sitosterol)豆甾醇(Stigmasterol)
3 讨论 Discussion
3.1 中医治疗股骨头坏死 中医学将股骨头坏死归于“骨痹”“骨痿”和“骨蚀”等范畴，如《灵枢刺节骨烛真邪篇》中提到“虚邪之入身也深，寒与热相传，久留而内著，内伤骨为骨蚀”。在股骨头坏死早期，患者多属气滞血瘀兼气血两虚证候，运用调和气血法治疗股骨头坏死尤为关键。股骨头坏死是一个病理演变过程，主要表现在股骨头软骨下骨的血管新生能力变差、骨形成相关细胞凋亡增加、成骨分化能力减弱、破骨细胞增殖异常及炎症细胞浸润等[11]。因此，寻找调节股骨头坏死病理生理机制的药物及其分子作用机制的研究具有重要意义。
图 1 ｜股骨头坏死相关芯片的差异表达基因Figure 1 ｜Differentially expressed genes on the chips related to osteo
necrosis of the femoral head图注：其中绿色代表下调基因，红色代表上调基因，其中差异最显著的5 个上调基因为
图 2 ｜活性化合物靶点-疾病靶点交集基因韦恩图Figure 2 ｜Venn diagram of active compoundsdisease intersecting genes图注：紫色饼状图代表股骨头坏死靶点，共6 045 个；黄色饼状图代表圣愈汤靶点，共196 个，二者交集得到73 个共有靶点
图 3 ｜活性成分-靶点网络Figure 3 ｜Active components-targets network图注：图中方形图标代表活性成分，其中灰色代表共同活性成分，绿色代表川芎活性成分，黄色代表白芍活性成分，紫色代表人参活性成分，蓝色代表黄芪活性成分，红色椭圆形图标代表靶点
图 4 ｜圣愈汤-活性成分-靶点-股骨头坏死调控网络Figure 4 ｜Regulatory network ofShengyuDecoction in the treatment of osteo
necrosis of the femoral head图注：红色椭圆图标表示股骨头坏死，绿色菱形图标表示与股骨头坏死密切相关的作用靶点，蓝色椭圆图标表示圣愈汤，紫色三角图标表示与圣愈汤中的各种有效成分
图 5 ｜圣愈汤治疗股骨头坏死的蛋白互作网络Figure 5 ｜Protein-protein interaction network ofShengyuDecoction in the treatment ofosteo
necrosis of the femoral head图注：圆形代表靶点，连线代表靶点之间存在互作关系，颜色与度值呈正相关，颜色越深在该网络中越重要
图 6 ｜圣愈汤治疗股骨头坏死的蛋白互作网络节点度值排序(Degree 值TOP20)Figure 6 ｜Ranking of node degrees of protein-protein interaction network regardingShengyuDecoction in the treatment of osteo
necrosis of the femoral head (top 20 of the degree)图注：纵坐标代表靶点的名称，横坐标为度值，代表靶点在蛋白互作网络中与其他靶点的连接数，度值越高代表该靶点与其他靶点的关系越密切，度值越低代表该靶点与其他靶点的关系越疏远
图 7 ｜GO 功能富集分析(TOP20)Figure 7 ｜GO functio
nal enrichment analysis (top 20)
图 8 ｜KEGG 信号通路点状图(TOP20)Figure 8 ｜Scatter diagram of KEGG signaling pathways (top 20)图注：图中横坐标为该通路所富集的基因占人体总基因的比例，气泡大小与通路上富集的基因数呈正比，气泡颜色越红则代表P值越小，其富集程度越显著，可信度越高
图 9 ｜山奈酚与白细胞介素6 的分子对接模式Figure 9 ｜Molecular docking diagram of kaempferol and interleukin-6
3.2圣愈汤能通过调节抗氧化、炎症反应、免疫调节和骨代谢等方面治疗股骨头坏死文章发现山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇和异鼠李素能匹配到较多疾病靶点，但作者查找以上化合物与股骨头坏死相关文献发现目前尚未有异鼠李素与股骨头坏死相关研究，值得今后进一步研究。核心靶点包括白细胞介素6，血管内皮生长因子A、J U N、M M P 9和白细胞介素1 β等，靶点间作用关系复杂多样。并富集到多条通路，包括和白细胞介素1 7、T o l l样受体、核转录因子κ B、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 α信号通路等，预测了圣愈汤可能通过调节炎症反应、骨代谢和血管生成等方面治疗股骨头坏死。因此可以认为圣愈汤有效成分间存在关联协同作用，其药效靶点对治疗股骨头坏死起重要作用。股骨头坏死发生机制可能与炎症反应、骨代谢异常和血管生成密切相关。Toll 样受体是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，该受体参与的信号通路与免疫性疾病或炎性疾病联系紧密[12]。核转录因子kB 信号通路是位于Toll 样受体下游的信号通路，在TLR4/核转录因子kB 信号通路中，TLR4被激活后释放大量炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6，1β 等[13]。白细胞介素6 即炎性细胞因子白细胞介素6，其受体在破骨细胞中表达[14]。肿瘤坏死因子α 是肿瘤坏死因子家族成员，能促进破骨细胞的增殖，亦能介导核转录因子kB 信号通路，活化核转录因子κB 以激活破骨细胞核心因子NFATc1，并增加OSCAR 的表达以促进破骨细胞分化[15]。白细胞介素1β 即炎性细胞因子白细胞介素1β，同样是促炎细胞因子，在损伤和病理早期表达上调，促进炎症因子释放[16]。白细胞介素1β 能刺激骨髓间充质干细胞分化，影响与炎症、血管生成和骨形成相关的蛋白质的分泌[17-18]。研究表明，白细胞介素6，4 和肿瘤坏死因子α 等炎性因子可能是导致股骨头坏死出现疼痛症状的主要发病机制之一，炎性因子大量释放，导致免疫细胞致大血管区域浸润，诱发血管区域免疫炎性反应，持续损伤血管，最终导致股骨头坏死[19-20]。此外，Toll 样受体4 还与影响成骨细胞的信号通路密切相关[21，23]。Toll 样受体4 信号通路被激活，成骨细胞标志物的表达被抑制，导致成骨细胞的分化、增殖和矿化受到抑制[24]。肿瘤坏死因子α 通过激活骨形态发生蛋白2 信号通路中核转录因子kB因子，减少磷酸化的Smad1，抑制成骨细胞分化，并通过抑制成骨细胞中的碱性磷酸酶来抑制骨形成和矿化[25-26]。另有研究表明，肿瘤坏死因子α 也可能诱导成骨分化[27]。股骨头坏死中表达显著升高[28]。可以认为肿瘤坏死因子α 在调节骨稳态中发挥关键作用，对股骨头坏死的修复有重要意义。白细胞介素17 是已知30 余种白细胞介素之一，由CD4+T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞合成分泌白细胞介素6、白细胞介素8、G-CSF 和前列腺素2 等因子。相关研究提示白细胞介素17 可能参与骨重建的调控。例如，白细胞介素17能抑制骨形态阿生蛋白2 诱导的成骨细胞分化[29-30]。另外，HUANG 等[31]发现白细胞介素17刺激间充质干细胞增殖，诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。这种对骨稳态的矛盾效应表明白细胞介素17 对成骨细胞分化可能存在双向调节作用。缺氧诱导因子1α 信号通路是最具特征性的低氧反应通路，缺氧诱导因子1α 可调节与血管生成相关靶基因的表达[32]。研究发现，股骨头坏死区缺氧诱导因子1α 和血管内皮生长因子的表达明显低于修复区[33]。缺氧诱导因子1α 的靶基因血管内皮生长因子在促进血管生成-成骨偶联过程中发挥重要作用[34]。血管内皮生长因子A 作为血管内皮生长因子家族成员，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进软骨内骨的形成，与股骨头坏死发病密切相关[35-36]。亦有研究表明缺氧诱导因子1α 可以抑制骨细胞凋亡，对激素性股骨头坏死起到防治作用[37-38]
槲皮素是黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎及免疫调节等作用，可促进成骨细胞增殖起到骨保护作用[39]。槲皮素通过p38 信号通路抑制巨噬细胞释放促炎因子，并介导核转录因子kB 信号通路抑制破骨细胞分化[40]。山柰酚具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等功效。研究表明山萘酚能增加成骨细胞活化因子RUNX-2，Osterix，骨形态发生蛋白2 和RHCg Ⅰ的表达，能使自噬相关因子表达增加，促进成骨细胞增殖[41]。β-谷甾醇有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等作用[42]。研究表明β-谷甾醇能通过调节与肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、白细胞介素6 和MMP-13 相关信号通路来减轻炎症、疼痛和慢性关节炎综合征，还能通过调节Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨细胞增殖，延缓骨吸收[43-44]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌和降胆固醇等作用，还能减轻骨关节炎症，抑制部分通过核转录因子kB 途径导致的软骨退化[45]。异鼠李素可促进AP-1 蛋白表达，进而激活细胞生长、分化和发育的相关基因；AP-1 蛋白在骨形成和骨吸收过程发挥重要作用[46]。文章通过对关键化合物分析，可以认为圣愈汤各有效成分之间存在紧密的协同作用，文章通过调节炎症反应、血管生成和骨代谢等生物学过程达到治疗股骨头坏死的效果。分子对接结果显示，核心靶蛋白分别与关键有效成分对接后获得的结合能均远小于参考值-5.0 k J/mol，表明圣愈汤能与股骨头坏死核心靶点受体蛋白稳定结合并发挥显著作用，基于此得到的网络分析结果可信度较高，参考价值较大。
3.3 中药与组织工程研究 骨髓间充质干细胞不但能自我更新、多向分化，还兼具低免疫原性及归巢能力，是骨及软骨组织工程中理想的种子细胞[47]。一定条件下骨髓间充质干细胞能向如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和血管内皮细胞转化[48]。针对股骨头坏死治疗，骨髓间充质干细胞联合传统保髋治疗取得了不错的疗效。XU 等[49]运用me
ta分析发现自体骨髓间充质干细胞移植联合髓芯减压术可明显减缓疾病进展阶段的股骨头塌陷，缓解疼痛，并延缓全髋关节置换。KANG 等[50]发现接受自体骨移植联合骨髓间充质干细胞治疗取得了较为满意的临床效果。相较于价格昂贵传统细胞因子和化学物质，中药复方、中药及中药单体用于诱导骨髓间充质干细胞分化方面有其独特优势。徐凌霄等[51]研究发现左归丸含药血清可促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。有研究发现黄酮类化合物金雀异黄酮促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制可能与激活p38/MAPK 信号通路相关[52]。有研究发现髓芯减压、自体干细胞移植联合中药治疗早中期股骨头缺血性坏死具有明显疗效[52]。中药对干细胞的研究仍需要深入，中药在干细胞领域具有重大潜力。基于此运用网络药理学寻找合适的中药复方、中药及其活性成分具有先导性的理论指导意义。3.4 结论与展望 文章应用网络药理学和分子对接技术对圣愈汤治疗股骨头坏死的机制进行了探究，发现圣愈汤可能通过多种信号通路调控血管内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞的增殖及凋亡，从而调控血管生成、骨吸收和骨形成的关系，同时抑制炎症反应，缓解股骨头坏死早期的临床症状，这为圣愈汤治疗股骨头坏死的相关机制研究提供了思路和方法，也为后续的临床及实验研究提供一定的理论指导。但由于条件限制，文章未能将中医方剂学“君臣佐使”配伍理念和疾病证候学加以运用，仅仅基于有效组分构建复方治疗疾病的研究。相信随着网络药理学、分子生物学的深入与完善，能将中药复方、中药及中药单体联合组织工程材料应用于骨组织工程研究。
作者贡献：作者贡献：文章成文由第一作者完成。文章责任人为第二作者。第三作者参与审校和终审定稿。第四、五、六作者完成数据核对。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81760796，81960803)；广西高校青年教师基础能力提升项目(2019KY0352)；广西中医药大学2019 年校级科研课题(2019QN027)； 广西自然科学基金课题(2015GXNSFAA139136)；广西中医药大学一流学科建设开放课题(2019XK029)；广西卫生厅重点课题(S201419-05)；2016 年全国名老中医黄有荣传承工作室建设项目；广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目-国医大师韦贵康学术思想传承与创新(2018004)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
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0 引言 Introduction股骨头坏死是股骨头血供中断或受损，引起骨细胞、骨髓成分死亡及骨组织异常修复，继而导致股骨头结构改变，股骨头塌陷，引起患者关节疼痛，功能障碍的疾病，是骨科常见的难治性疾病[1]。据流行病学调查研究显示，中国目前约有800 万例股骨头坏死患者，且每年有(10-20)万例的新发病例[2]。相当一部分股骨头坏死患者是年轻人(20-40 岁)，这类患者髋关节置换后假体的使用寿命并不理想，面临多次翻修手术的风险；此外，部分老年患者因存在慢性基础性疾病，并不适合手术，保髋治疗是更好的选择。近年来，经过大量临床观察及动物实验证实，中医药在治疗股骨头坏死方面具有显著疗效，不仅可以改善坏死状态，而且能修复坏死的骨组织[3]。中医治疗股骨头坏死的研究发现患者病机因多属血瘀痰阻、经络阻滞兼有肝肾亏虚、气血不足，与中华中医药学会发布《股骨头坏死中医辨证标准》相符[4]。圣愈汤载于朱震亨《脉因证治·金疮》，由人参、黄芪、熟地、当归、白芍和川芎6 味药组成，具有益气补血、活血化瘀的功效。施杞教授创立“调和气血法”，总结出以圣愈汤为基础的治疗股骨头坏死方剂，将益气养血、行气活血贯穿于治疗股骨头坏死过程的始终[5]。刘粉叶等[6]发现圣愈汤能通过促进骨髓造血细胞增殖，其机制与促进造血生长因子的合成和分泌，与中医益气活血理论相符。由于圣愈汤所含化学成分较为复杂，其治疗股骨头坏死的机制尚不明确。因此，文章旨在通过网络药理学方法，挖掘圣愈汤入血活性成分、作用靶点与股骨头坏死作用靶点关系网络，分析其潜在作用机制。1.1.2 检索时间及地点 于2020 年4月至5 月在广西中医药大学附属瑞康医院完成。1.1.3 检索数据库 见表1。1.2 圣愈汤活性成分筛选和靶点预测运用TCMSP 中检索圣愈汤的6 味中药为人参(脾经、肺经、心经、肾经)、黄芪(归肺经、脾经)、熟地(肺经、肾经)、当归(心经、肝经、脾经)、白芍(胃经、肾经)和川芎(肝经、胆经)。以上中药归经信息均参考自中医药百科全书(Encyclopaedia of Traditio
nal Chinese Medicin，ETCM)[7]。1 资料和方法 Data and methods1.1 软件与数据库1.1.1 检索人 第一作者进行检索，通讯作者核对。根据数据库建议参考标准：生物口服利用度(oral bioavailability，OB) ≥30% 和 类 药 性(drug likeness，DL)≥0.18 作为筛选标准，确定圣愈汤中所含中药活性成分的集合。基于TCMSP 数据库查询每个活性成分对应的靶蛋白，基于TCMSP 数据库，将获得的活性成分逐一配对潜在作用靶点，再通过Uniprot 数据库进行靶点蛋白和基因信息校正，筛选出圣愈汤主要活性成分的作用靶点。表1 ｜检索的软件与数据库Table 1 ｜Software and databa
ses used for data retrival序号 名称 网址 版本1 中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php 2.3 2 UniProt 数据库 https://www.uniprot.org 更新于2020-05-05 3 Gene ex
pression Omnibus数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo 更新于2020-05-05 4 Venny 软件 http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html 2.1.0 5 Cytoscape 软件 http://www.cytoscape.org/ 3.7.2 6 STRING 数据库 http://string-db.org/cgi/input.pl 11.0 7 DAVID 数据库 http://david.ncifcrf.gov. 6.8 8 R 语言软件 http://www.r-project.org/ 3.6.2 9 PDB 数据库 http://www.rcsb.org/ 更新于2020-05-05 10 Pubchem 数据库 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 更新于2020-05-05 11 PyMOL 软件 https://pymol.org/2/ 1.7.2.1 12 AutoDuckTools 软件 http://autodock.scripps.edu/resources/adt 1.5.6 13 Autodock vina 软件 http://vina.scripps.edu 1.1.21.3 股骨头坏死靶点预测 以“Osteo
necrosis of the femoral head”为关键词在GeneCards、以及OMIM数据库中查找与股骨头坏死相关靶点。再从Gene ex
pression Omnibus 数据库下载编号为：GSE74089 的芯片数据原始文件[8]，此芯片收集4 例股骨头坏死患者和4 名健康对照者髋关节软骨标本的基因测序信息，利用R 语言软件中的limma 包分析芯片数据的差异基因，设置差异倍数(Fold change，FC) ＞ 0.5，显著差异基因的筛选条件为P＜ 0.05；最后运用pheatmap 包对差异基因绘制差异基因热图和火山图，同时保存股骨头坏死患者和健康对照之间的差异基因。采用两独立样本t检验检测组间数据差异，用FDR 错误控制法对P值作多重假设检验校正。将差异分析得到的基因与GeneCards 和OMIM 数据库的查找结果合并，删除重复靶点保留惟一项，所得靶点即为股骨头坏死的相关靶点。1.4 圣愈汤治疗股骨头坏死共同靶点筛选 将圣愈汤活性成分靶点和股骨头坏死相关靶点经Venny 2.1.0 软件取交集，获得圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点。1.5 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络及分析 使用可视化网络构建与分析软件Cytoscape 3.7.2，根据得到的圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点，整合对应有效成分导入，建立“活性成分-靶点”网络，同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络。同时利用插件Cyto
nCA 计算网络节点的自由度(Degree)，Degree 大小与相关节点数量呈正比，据此筛选出靶点数目较多的活性成分。1.6 构建共同靶点的蛋白互作网络 将上述共同靶点导入STRING 数据库，选择物种为人，以最低要求互动得分(minimum required interaction score)0.7为筛选参数，得到圣愈汤治疗股骨头坏死的PPI 网络，在构建的PPI 网络中，节点的大小和颜色深浅反映自由度(Degree)值大小，边粗细反映组合分数(combine score)大小。导出“TSV”文件并运用Cytoscape 3.7.2 软件中Network Analyzer 工具分析网络中节点的度值，根据度值的排序确定核心靶点。1.7 GO 富集分析与KEGG 富集分析利用DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov，Version 6.8)对潜在靶点进行GO功能富集分析，研究圣愈汤治疗股骨头坏死生物功能；KEGG 富集分析潜在靶点的相关通路，研究圣愈汤治疗股骨头坏死的主要信号通路，P＜ 0.01 代表富集结果显著。最后利用R 语言绘制GO富集分析图及KEGG 富集分析气泡图。1.8 分子对接验证 采用Autodock vina分子对接软件来验证网络药理学筛选结果。在上述步骤结果基础上，选择靶点数目较多的活性成分作为配体和PPI 网络关系图中度值排名前5 的靶蛋白作为受体进行分子对接。从PDB 数据库中查询以上靶蛋白的3D 结构。用PyMOL 1.7.2.1 软件进行预处理，移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)。从PubChem 数据库下载筛选出关键化合物结构，并基于MMFF94 力场对化合物的结构进行优化。使用AutodockTools软件对化合物进行可旋转键的搜寻与定义[9]；对DPE 蛋白结构通过多肽链缺失残基和末端残基修补、除去水分子、添加氢原子、添加电荷，并保存为PDBQT格式。以原配体所在位点为靶蛋白的活性口袋，分别进行靶蛋白与活性化合物的分子对接。如蛋白没有原配体，则以蛋白和dna 相互作用的残基构建活性口袋进行对接。得出结合自由能(ΔGbind，kJ/mol)，根据文献报道[10]，这里选取结合能≤-5.0 k J/mol 的活性成分作为验证“成分-靶点”的筛选依据。选取“1.5”项中度值最高化合物和“1.6”项度值最高靶点对接结合构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol 进行作图。1.9 主要观察指标 主要观察关键基因在KEGG 和GO 富集结果，关键基因与关键化合物分子对接结果。2 结果 Results2.1 活性化合物的筛选结果 通过TCMSP 数据库检索共收集得到圣愈汤的化学成分752 个，其中黄芪87 个，人 参190 个， 白 芍85 个， 熟 地76个，当归125 个，川芎189 个，再以OB ≥30%和DL ≥0.18 为活性成分筛选条件对752 个成分进行筛选，得到复方中共66 个活性化学成分，黄芪、人参、芍药、熟地、当归和川芎的活性成分分别为20，22，13，2，2 和7 个，其中白芍和黄芪有1 个交集化合物，白芍、黄芪和人参有1 个交集化合物，川芎和黄芪有1 个交集化合物，当归、白芍和人参有1 个交集化合物，熟地、当归和人参有1 个交集化合物，主要活性成分的基本信息见表2。2.2 股骨头坏死相关靶点筛选结果 根据筛选条件，对GEO 芯片数据库的基因芯片的二次分析获得5 443 个差异表达基因，运用R 语言软件绘制股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的火山图和股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的聚类图见图1。这些基因可能与股骨头坏死的发生发展密切相关；通过GeneCards和OMIM 数据库收集对股骨头坏死有意义的靶点736 个；删除重复项后纳入6 045 个候选基因。表2 ｜圣愈汤中潜在活性成分基本信息Table 2 ｜Basic information of potential active compo
nents inShengyuDecoction编号 ID 化学成分 生物口服利用度(%)类药性 来源64.77 0.38 白芍2 MOL001918 芍药苷元(paeoniflorgenone) 87.59 0.37 白芍3 MOL001919 (3S，5R，8R，9R，10S，14S)-3，17-dihydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-2，3，5，6，7，9-hexahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthrene-15，16-dione 1 MOL001910 11alpha，12alpha-epoxy-3beta-23-dihydroxy-30-norolean-20-en-28，12beta-olide 43.56 0.53 白芍4 MOL001921 芍药新苷(Lactiflorin) 49.12 0.80 白芍5 MOL001924 芍药苷(paeoniflorin) 53.87 0.79 白芍6 MOL001925 芍药苷_qt(paeoniflorin_qt) 68.18 0.40 白芍7 MOL001928 芍药内酯苷_qt(albiflorin_qt) 66.64 0.33 白芍8 MOL001930 苯甲酰芍药甙(benzoyl paeoniflorin) 31.27 0.75 白芍9 MOL000211 丁子香萜(Mairin) 55.38 0.78 白芍、黄芪10 MOL000422 山奈酚(kaempferol) 41.88 0.24 白芍、黄芪、人参11 MOL000492 (+)-儿茶素((+)-catechin) 54.83 0.24 白芍12 MOL001494 亚油酸乙酯(Mandenol) 42.00 0.19 川芎13 MOL002135 MYRICANONE(Myricanone) 40.60 0.51 川芎14 MOL002140 川芎哚(Perlolyrine) 65.95 0.27 川芎15 MOL002151 洋川芎醌(senkyunone) 47.66 0.24 川芎16 MOL002157 萘呋内酯(wallichilide) 42.31 0.71 川芎17 MOL000359 谷甾醇(sitosterol) 36.91 0.75 熟地、川芎、白芍18 MOL000433 FA 68.96 0.71 川芎、黄芪19 MOL000358 β 谷甾醇(beta-sitosterol) 36.91 0.75 当归、白芍、人参20 MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 43.83 0.76 熟地、当归、人参21 MOL000239 熊竹素(Jaranol) 50.83 0.29 黄芪22 MOL000296 三萜皂苷(hederagenin) 36.91 0.75 黄芪23 MOL000033 (3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-dimethyl-36.23 0.78 黄芪17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol 24 MOL000354 异鼠李素(isorhamnetin) 49.6 0.31 黄芪25 MOL000371 3，9-di-O-methylnissolin 53.74 0.48 黄芪26 MOL000374 5'-hydroxyiso-muronulatol-2'，5'-di-O-glucoside 41.72 0.69 黄芪27 MOL000378 7-O-methylisomucro
nulatol 74.69 0.3 黄芪28 MOL000379 9，10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside 36.74 0.92 黄芪29 MOL000380 (6aR，11aR)-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6Hbenzofurano[3，2-c]chromen-3-ol 64.26 0.42 黄芪30 MOL000387 联苯双酯(Bifendate) 31.10 0.67 黄芪31 MOL000392 芒柄花黄素(formononetin) 69.67 0.21 黄芪32 MOL000398 异黄烷酮(isoflavanone) 109.99 0.30 黄芪33 MOL000417 毛蕊异黄酮(Calycosin) 47.75 0.24 黄芪34 MOL000438 (3R)-3-(2-hydroxy-3，4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 67.67 0.26 黄芪35 MOL000439 (isomucronulatol-7，2'-di-O-glucosiole) 49.28 0.62 黄芪36 MOL000442 1，7-Dihydroxy-3，9-dimethoxy pterocarpene 39.05 0.48 黄芪37 MOL000098 槲皮素(quercetin) 46.43 0.28 黄芪38 MOL002879 酞酸酯(Diop) 43.59 0.39 人参39 MOL003648 朝鲜槐英(Inermin) 65.83 0.54 人参40 MOL004492 菊黄质(Chrysanthemaxanthin) 38.72 0.58 人参41 MOL005308 阿朴天仙子碱(Aposiopolamine) 66.65 0.22 人参42 MOL005314 南蛇藤苄酰胺(Celabenzine) 101.88 0.49 人参43 MOL005317 脱氧三尖杉酯碱(Deoxyharringtonine) 39.27 0.81 人参44 MOL005318 石竹胺(Dianthramine) 40.45 0.20 人参45 MOL005320 花生四烯酸(arachidonate) 45.57 0.20 人参46 MOL005321 紫穗槐酮甲(Frutinone A) 65.90 0.34 人参47 MOL005344 人参皂苷 rh2(ginsenoside rh2) 36.32 0.56 人参48 MOL005348 人参皂苷 Rh4_qt(Ginsenoside Rh4_qt) 31.11 0.78 人参49 MOL005356 吉九里香碱(Girinimbine) 61.22 0.31 人参50 MOL005357 五味子酯乙(Gomisin B) 31.99 0.83 人参51 MOL005360 马尔肯久纳醇苯酯(malkangunin) 57.71 0.63 人参52 MOL005376 人参二醇(Panaxadiol) 33.09 0.79 人参53 MOL005384 苏齐内酯(suchilactone) 57.52 0.56 人参54 MOL005399 胡萝卜甙_qt(alexandrin_qt) 36.91 0.75 人参55 MOL005401 人参皂苷 Rg5_qt(ginsenoside Rg5_qt) 39.56 0.79 人参56 MOL000787 蓝堇碱 (Fumarine) 59.26 0.83 人参2.3 圣愈汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测结果 在TCMSP 数据库得到的圣愈汤中活性成分靶点196 个；GEO 差异分析、GeneCards 和OMIM 数据库中获得股骨头坏死的相关靶点6 045 个，通过Venny 平台取交集后显示，圣愈汤与股骨头坏死药物-疾病交集靶基因共73 个，见图2。2.4 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络 运用Cytoscape 软件构建“活性成分-靶点”网络，见图3，共包括100 个节点(27 个活性成分节点和73 个靶点节点)和182 条边。同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”，见图4。使用Network analyze 功能对网络进行拓扑属性分析，其中度值是衡量1 个节点在网络中关键性的重要参数。该网络中度值排名前5 位的化合物分别是山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆 甾 醇(Stigmasterol)和异鼠李素(isorhamnetin)、分别能与65，45，43，14，10 个靶点连接，对治疗股骨头坏死具有重要的意义，其基本信息见表3。2.5 PPI 网络及网络拓扑分析结果 通过STRING 数据库以最低要求互动得分(minimum required interaction score) 为0.7 为筛选参数分析共得到233 对蛋白互作关系，涉及73 个蛋白靶点。采用Cytoscape 软件构建蛋白互作网络，见图5。文章通过Network Analyzer 工具分析网络中节点的度值，将度值≥8(均值)的靶点由高到低排序，见图6。度值排名前5 的蛋白基因是炎性细胞因子白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、原癌基因蛋白(Proto-o
ncogene proteins，JUN)、 基 质金属肽酶9(Matrix me
talloproteinase-9，MMP9)及炎性细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1 beta，IL-1β)。这些蛋白在整个网络中起着关键的作用，蛋白所对应的靶点在圣愈汤治疗治疗股骨头坏死中具有重要作用，认为是圣愈汤治疗股骨头坏死的关键靶点。2.6 GO 富集分析结果 GO 富集分析得到GO 条目共804 个(P＜ 0.01)，其中生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)条目分别为732，23，49 个。从生物过程的相关条目分析，圣愈汤治疗股骨头坏死的靶点主要参与对炎 症 反 应(Inflammatory reaction)、氧 化应激反应(respo
nse to oxidative stress)和血管生成调节(regulation of angiogenesis)等过程；从细胞组成的相关条目分析，治疗靶点主要包括转录因子复合体(trans
cription factor complex)、内质网腔(intrinsic compo
nent of postsynaptic) 及核染色质(RNA polymerase II trans
cription factor)等区域；从分子功能的相关条目分子，治疗靶点主要与丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、调 节 核 受 体活性(nuclear receptor activity)和蛋白酶结合(protease binding)等方面相关。根据P值排序，每个模块前20 位的条目见图7。2.7 KEGG 富集分析结果 KEGG 通路富集分析共得到120 条通路，根据P值排序，列出前20 位条目，见图8。主要涉及缺氧诱导因子1α 信号通路、白细胞介素17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子B 信号通路和Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路等，这些通路与炎症反应、骨代谢、血管生成和免疫调节密切相关。2.8 分子对接验证 将“2.4”项筛选出的关键化合物和“2.5”项的关键靶蛋白进行分子对接验证。分子对接结果显示圣愈汤关键活性化合物与靶蛋白的分子对接亲和力均远小于-5.0 kJ/mol，结果表明圣愈汤中关键化合物与关键靶蛋白有较好的结合活性，结果见表4。山奈酚为预测靶点最多的活性成分，白细胞介素6 为PPI 网络中degree 值最大的靶点，以山奈酚和白细胞介素6 蛋白结构对接模式为例，结果显示山柰酚能稳定地对接到白细胞介素6 蛋白结构的活性口袋中，见图9；山奈酚与白细胞介素6 蛋白结合关键疏水氨基酸残基是ASP-1042，ARG-01041，GLY-1097，GLN-1098，THR-1100，PHE-1046，MET-1085，VAL-1045 和HIS-1096。表3 ｜关键化合物的基本信息Table 3 ｜The basic information on the key compoundsMOLID 化学成分 度值 来源 结构MOL000422 山柰酚(kaempferol) 65 白芍、黄芪、人参MOL000098 槲皮素(quercetin) 45 黄芪MOL000358 β-谷甾醇(beta-sitosterol) 43 白芍、当归MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 14 当归、人参、熟地MOL000354 异鼠李素(isorhamnetin) 10 黄芪表4 ｜关键化合物与核心靶点的结合能 (kJ/mol)Table 4 ｜The binding energy values of the core compounds异鼠李素(isorhamnetin)白细胞介素6 -30.124 8 -36.801 6 -24.255 6 -28.855 8 -37.219 8血管内皮生长因子A -28.019 4 -28.855 8 -27.601 2 -30.110 4 -27.183 JUN -39.729 -39.310 8 -35.965 2 -34.292 4 -38.474 4基质金属蛋白酶9 -23.419 2 -22.582 8 -13.800 6 -20.91 -21.328 2白细胞介素1β -30.526 8 -30.114 -29.274 1 -28.019 4 -30.110 4基因 山柰酚(kaempferol)槲皮素(quercetin)β-谷甾醇(beta-sitosterol)豆甾醇(Stigmasterol)3 讨论 Discussion3.1 中医治疗股骨头坏死 中医学将股骨头坏死归于“骨痹”“骨痿”和“骨蚀”等范畴，如《灵枢刺节骨烛真邪篇》中提到“虚邪之入身也深，寒与热相传，久留而内著，内伤骨为骨蚀”。在股骨头坏死早期，患者多属气滞血瘀兼气血两虚证候，运用调和气血法治疗股骨头坏死尤为关键。股骨头坏死是一个病理演变过程，主要表现在股骨头软骨下骨的血管新生能力变差、骨形成相关细胞凋亡增加、成骨分化能力减弱、破骨细胞增殖异常及炎症细胞浸润等[11]。因此，寻找调节股骨头坏死病理生理机制的药物及其分子作用机制的研究具有重要意义。图 1 ｜股骨头坏死相关芯片的差异表达基因Figure 1 ｜Differentially expressed genes on the chips related to osteo
necrosis of the femoral head图注：其中绿色代表下调基因，红色代表上调基因，其中差异最显著的5 个上调基因为图 2 ｜活性化合物靶点-疾病靶点交集基因韦恩图Figure 2 ｜Venn diagram of active compoundsdisease intersecting genes图注：紫色饼状图代表股骨头坏死靶点，共6 045 个；黄色饼状图代表圣愈汤靶点，共196 个，二者交集得到73 个共有靶点图 3 ｜活性成分-靶点网络Figure 3 ｜Active components-targets network图注：图中方形图标代表活性成分，其中灰色代表共同活性成分，绿色代表川芎活性成分，黄色代表白芍活性成分，紫色代表人参活性成分，蓝色代表黄芪活性成分，红色椭圆形图标代表靶点图 4 ｜圣愈汤-活性成分-靶点-股骨头坏死调控网络Figure 4 ｜Regulatory network ofShengyuDecoction in the treatment of osteo
necrosis of the femoral head图注：红色椭圆图标表示股骨头坏死，绿色菱形图标表示与股骨头坏死密切相关的作用靶点，蓝色椭圆图标表示圣愈汤，紫色三角图标表示与圣愈汤中的各种有效成分图 5 ｜圣愈汤治疗股骨头坏死的蛋白互作网络Figure 5 ｜Protein-protein interaction network ofShengyuDecoction in the treatment ofosteo
necrosis of the femoral head图注：圆形代表靶点，连线代表靶点之间存在互作关系，颜色与度值呈正相关，颜色越深在该网络中越重要图 6 ｜圣愈汤治疗股骨头坏死的蛋白互作网络节点度值排序(Degree 值TOP20)Figure 6 ｜Ranking of node degrees of protein-protein interaction network regardingShengyuDecoction in the treatment of osteo
necrosis of the femoral head (top 20 of the degree)图注：纵坐标代表靶点的名称，横坐标为度值，代表靶点在蛋白互作网络中与其他靶点的连接数，度值越高代表该靶点与其他靶点的关系越密切，度值越低代表该靶点与其他靶点的关系越疏远图 7 ｜GO 功能富集分析(TOP20)Figure 7 ｜GO functio
nal enrichment analysis (top 20)图 8 ｜KEGG 信号通路点状图(TOP20)Figure 8 ｜Scatter diagram of KEGG signaling pathways (top 20)图注：图中横坐标为该通路所富集的基因占人体总基因的比例，气泡大小与通路上富集的基因数呈正比，气泡颜色越红则代表P值越小，其富集程度越显著，可信度越高图 9 ｜山奈酚与白细胞介素6 的分子对接模式Figure 9 ｜Molecular docking diagram of kaempferol and interleukin-63.2圣愈汤能通过调节抗氧化、炎症反应、免疫调节和骨代谢等方面治疗股骨头坏死文章发现山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇和异鼠李素能匹配到较多疾病靶点，但作者查找以上化合物与股骨头坏死相关文献发现目前尚未有异鼠李素与股骨头坏死相关研究，值得今后进一步研究。核心靶点包括白细胞介素6，血管内皮生长因子A、J U N、M M P 9和白细胞介素1 β等，靶点间作用关系复杂多样。并富集到多条通路，包括和白细胞介素1 7、T o l l样受体、核转录因子κ B、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 α信号通路等，预测了圣愈汤可能通过调节炎症反应、骨代谢和血管生成等方面治疗股骨头坏死。因此可以认为圣愈汤有效成分间存在关联协同作用，其药效靶点对治疗股骨头坏死起重要作用。股骨头坏死发生机制可能与炎症反应、骨代谢异常和血管生成密切相关。Toll 样受体是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，该受体参与的信号通路与免疫性疾病或炎性疾病联系紧密[12]。核转录因子kB 信号通路是位于Toll 样受体下游的信号通路，在TLR4/核转录因子kB 信号通路中，TLR4被激活后释放大量炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6，1β 等[13]。白细胞介素6 即炎性细胞因子白细胞介素6，其受体在破骨细胞中表达[14]。肿瘤坏死因子α 是肿瘤坏死因子家族成员，能促进破骨细胞的增殖，亦能介导核转录因子kB 信号通路，活化核转录因子κB 以激活破骨细胞核心因子NFATc1，并增加OSCAR 的表达以促进破骨细胞分化[15]。白细胞介素1β 即炎性细胞因子白细胞介素1β，同样是促炎细胞因子，在损伤和病理早期表达上调，促进炎症因子释放[16]。白细胞介素1β 能刺激骨髓间充质干细胞分化，影响与炎症、血管生成和骨形成相关的蛋白质的分泌[17-18]。研究表明，白细胞介素6，4 和肿瘤坏死因子α 等炎性因子可能是导致股骨头坏死出现疼痛症状的主要发病机制之一，炎性因子大量释放，导致免疫细胞致大血管区域浸润，诱发血管区域免疫炎性反应，持续损伤血管，最终导致股骨头坏死[19-20]。此外，Toll 样受体4 还与影响成骨细胞的信号通路密切相关[21，23]。Toll 样受体4 信号通路被激活，成骨细胞标志物的表达被抑制，导致成骨细胞的分化、增殖和矿化受到抑制[24]。肿瘤坏死因子α 通过激活骨形态发生蛋白2 信号通路中核转录因子kB因子，减少磷酸化的Smad1，抑制成骨细胞分化，并通过抑制成骨细胞中的碱性磷酸酶来抑制骨形成和矿化[25-26]。另有研究表明，肿瘤坏死因子α 也可能诱导成骨分化[27]。股骨头坏死中表达显著升高[28]。可以认为肿瘤坏死因子α 在调节骨稳态中发挥关键作用，对股骨头坏死的修复有重要意义。白细胞介素17 是已知30 余种白细胞介素之一，由CD4+T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞合成分泌白细胞介素6、白细胞介素8、G-CSF 和前列腺素2 等因子。相关研究提示白细胞介素17 可能参与骨重建的调控。例如，白细胞介素17能抑制骨形态阿生蛋白2 诱导的成骨细胞分化[29-30]。另外，HUANG 等[31]发现白细胞介素17刺激间充质干细胞增殖，诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。这种对骨稳态的矛盾效应表明白细胞介素17 对成骨细胞分化可能存在双向调节作用。缺氧诱导因子1α 信号通路是最具特征性的低氧反应通路，缺氧诱导因子1α 可调节与血管生成相关靶基因的表达[32]。研究发现，股骨头坏死区缺氧诱导因子1α 和血管内皮生长因子的表达明显低于修复区[33]。缺氧诱导因子1α 的靶基因血管内皮生长因子在促进血管生成-成骨偶联过程中发挥重要作用[34]。血管内皮生长因子A 作为血管内皮生长因子家族成员，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进软骨内骨的形成，与股骨头坏死发病密切相关[35-36]。亦有研究表明缺氧诱导因子1α 可以抑制骨细胞凋亡，对激素性股骨头坏死起到防治作用[37-38]槲皮素是黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎及免疫调节等作用，可促进成骨细胞增殖起到骨保护作用[39]。槲皮素通过p38 信号通路抑制巨噬细胞释放促炎因子，并介导核转录因子kB 信号通路抑制破骨细胞分化[40]。山柰酚具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等功效。研究表明山萘酚能增加成骨细胞活化因子RUNX-2，Osterix，骨形态发生蛋白2 和RHCg Ⅰ的表达，能使自噬相关因子表达增加，促进成骨细胞增殖[41]。β-谷甾醇有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等作用[42]。研究表明β-谷甾醇能通过调节与肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、白细胞介素6 和MMP-13 相关信号通路来减轻炎症、疼痛和慢性关节炎综合征，还能通过调节Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨细胞增殖，延缓骨吸收[43-44]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌和降胆固醇等作用，还能减轻骨关节炎症，抑制部分通过核转录因子kB 途径导致的软骨退化[45]。异鼠李素可促进AP-1 蛋白表达，进而激活细胞生长、分化和发育的相关基因；AP-1 蛋白在骨形成和骨吸收过程发挥重要作用[46]。文章通过对关键化合物分析，可以认为圣愈汤各有效成分之间存在紧密的协同作用，文章通过调节炎症反应、血管生成和骨代谢等生物学过程达到治疗股骨头坏死的效果。分子对接结果显示，核心靶蛋白分别与关键有效成分对接后获得的结合能均远小于参考值-5.0 k J/mol，表明圣愈汤能与股骨头坏死核心靶点受体蛋白稳定结合并发挥显著作用，基于此得到的网络分析结果可信度较高，参考价值较大。3.3 中药与组织工程研究 骨髓间充质干细胞不但能自我更新、多向分化，还兼具低免疫原性及归巢能力，是骨及软骨组织工程中理想的种子细胞[47]。一定条件下骨髓间充质干细胞能向如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和血管内皮细胞转化[48]。针对股骨头坏死治疗，骨髓间充质干细胞联合传统保髋治疗取得了不错的疗效。XU 等[49]运用me
ta分析发现自体骨髓间充质干细胞移植联合髓芯减压术可明显减缓疾病进展阶段的股骨头塌陷，缓解疼痛，并延缓全髋关节置换。KANG 等[50]发现接受自体骨移植联合骨髓间充质干细胞治疗取得了较为满意的临床效果。相较于价格昂贵传统细胞因子和化学物质，中药复方、中药及中药单体用于诱导骨髓间充质干细胞分化方面有其独特优势。徐凌霄等[51]研究发现左归丸含药血清可促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。有研究发现黄酮类化合物金雀异黄酮促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制可能与激活p38/MAPK 信号通路相关[52]。有研究发现髓芯减压、自体干细胞移植联合中药治疗早中期股骨头缺血性坏死具有明显疗效[52]。中药对干细胞的研究仍需要深入，中药在干细胞领域具有重大潜力。基于此运用网络药理学寻找合适的中药复方、中药及其活性成分具有先导性的理论指导意义。3.4 结论与展望 文章应用网络药理学和分子对接技术对圣愈汤治疗股骨头坏死的机制进行了探究，发现圣愈汤可能通过多种信号通路调控血管内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞的增殖及凋亡，从而调控血管生成、骨吸收和骨形成的关系，同时抑制炎症反应，缓解股骨头坏死早期的临床症状，这为圣愈汤治疗股骨头坏死的相关机制研究提供了思路和方法，也为后续的临床及实验研究提供一定的理论指导。但由于条件限制，文章未能将中医方剂学“君臣佐使”配伍理念和疾病证候学加以运用，仅仅基于有效组分构建复方治疗疾病的研究。相信随着网络药理学、分子生物学的深入与完善，能将中药复方、中药及中药单体联合组织工程材料应用于骨组织工程研究。作者贡献：作者贡献：文章成文由第一作者完成。文章责任人为第二作者。第三作者参与审校和终审定稿。第四、五、六作者完成数据核对。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81760796，81960803)；广西高校青年教师基础能力提升项目(2019KY0352)；广西中医药大学2019 年校级科研课题(2019QN027)； 广西自然科学基金课题(2015GXNSFAA139136)；广西中医药大学一流学科建设开放课题(2019XK029)；广西卫生厅重点课题(S201419-05)；2016 年全国名老中医黄有荣传承工作室建设项目；广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目-国医大师韦贵康学术思想传承与创新(2018004)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] 赵德伟,胡永成.成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012 年版)[J].中华关节外科杂志(电子版),2012,6(3):479-484[2] ZHAO DW, YU M, HU K, et al. Pre
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文章来源：中医药文化 网址: http://zyywh.400nongye.com/lunwen/itemid-6976.shtml
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