0 引言 Introduction
骨关节炎是最常见的关节疾病，是导致残疾的主要原因。个体遗传易感性、衰老、肥胖和关节排列不良等几个危险因素与骨关节炎密切相关[1-2]。在中医学中并无骨关节炎的病名，但据其临床表现可归属于中医学骨痹范畴，《中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)》将其分为肝肾亏虚、气血虚弱、寒湿痹阻、湿热痹阻及气滞血瘀共5 个证型，其治疗原则多为滋补肝肾、补气养血、温经散寒、清热除湿和活血化瘀等[3]。目前骨关节炎的诊断仅是基于临床症状和影像学标准，病因至今未明，为骨伤科治疗难题之一，因此，亟需探明有效的骨关节炎防治策略。因中医药治疗骨关节炎的不良反应较小，临床疗效肯定，近年来研究者对中药复方治疗骨关节炎作用机制的探究也越来越多。龟鹿二仙胶最早见于《医便》，由龟板胶、鹿角胶、人参和枸杞组成，诸药合用，共奏补益肝肾、填精益髓及助阳益气之功[4]。临床研究表明龟鹿二仙胶方治疗骨关节炎效果显著，能明显改善患者的临床症状[5-7]。此外，龟鹿二仙胶防治骨关节炎的作用机制也取得了一定的进展，研究表明龟鹿二仙胶能抑制软骨细胞凋亡、延缓软骨外基质降解及减少炎症因子表达[8-11]，但由于龟鹿二仙胶复方成分较复杂，其作用于骨关节炎的具体机制仍缺乏有力证据证明。
网络药理学集合了数据挖掘、靶点预测和高通量数据整合等多种研究方法，它把中药成分靶点间的相互作用和联系系统的展现出来，还能整体分析中药复方多成分的作用机制，其系统性和整体性与中医药辨证论治、整体观念的原则具有很大程度的一致性，深入推动了中药复方药效分子机制的研究[12-13]。文章基于网络药理学，通过数据挖掘与分析，筛选和系统预测龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的潜在作用靶点和信号通路，为龟鹿二仙胶临床精准定位提供药理学依据，为进一步的基础研究以及临床应用提供了新的思路与线索。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 数据库、软件及分析平台 作者于2020 年2 月至5 月运用生物信息学和数据挖掘技术检索以下10 个数据库的文献，见表1。
1.2 分析方法
1.2.1 龟鹿二仙胶活性成分的获取及靶点筛选 利用TCMSP，BATMAN-TCM和TCMID 数据库收集龟鹿二仙胶中龟板胶、鹿角胶、人参及枸杞的化学成分，基于口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 进行筛选[14-15]，同时查阅文献对未纳入数据库但已报道具生物活性和药理作用的也一并纳入，最终确定其活性成分。通过 TCMSP 和Drug Bank 数据库查询活性成分相对应的靶标蛋白，并利用 Unitprot 数据库查询靶标蛋白对应的基因名称，剔除非人类的靶点蛋白[16]，最终整理得到龟鹿二仙胶的活性成分及其对应靶点。
1.2.2 骨关节炎靶点筛选预测 利用GeneCards 和OMIM 数 据 库， 以“osteoarthritis”为关键词，对骨关节炎相关靶点进行检索及筛选，将所有筛选结果合并去重后得到骨关节炎的相关靶标信息。
1.2.3 网络构建与分析 利用Perl 语言将所得药物活性成分靶点与骨关节炎疾病靶点相映射，得到龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的预测靶点。将交集得到的靶点导入String 数据库[17]，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并用Cytoscape 3.7.2软件中的Cyto
nCA 插件对所得的蛋白质相互作用网络数据进行分析，借助度中心性(DC)和介度中心性(BC)指标进行筛选，首先筛选大于2 倍中位数的度中心性值的节点，筛选完成后根据初筛结果继续筛选大于每个指标所对应的中位数的节点[18]，得到龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键靶点。
表1 ｜数据库及软件Table 1 ｜Databa
ses and software序号 数据库及软件名称 网址1 中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP) http: //lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php 2 中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM) http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/3 中医药综合数据库(TCMID) http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx 4 Drug Bank 数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 5 Unitprot 数据库 http://www.Unitprot.org/6 cytoscape 3.6.2 软件 https://cytoscape.org/7 蛋白质相互作用数据库(STRING) https://string-db.org/8 真核生物基因组自动注释数据库(Ensembl) http://asia.ensembl.org/index.html 9 GeneCards 数据库 https://www.genecards.org 10 OMIM 数据库 https://www.omim.org/
1.2.4 基因本体论(gene ontology，GO)富集分析 首先，使用R 语言(版本3.6.2)软件将龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的靶点进行ID 转换，为下一步做基础；其次，在R 语言中调用生物类的程序包，如clusterProfiler，bioco
nductor 等对关键靶点进行GO 富集分析(P＜ 0.05)，得到GO 富集分析结果，其中包括龟鹿二仙胶治疗骨关节炎靶点的生物学过程(biological process，BP)、分子生物学功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)等具体数据，通过对基因的富集分析预测龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的可能机制。
1.2.5 京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)富集分析及KEGG 关系网络的构建 使用R 语言对关键靶点进行KEGG富集分析(P＜ 0.05)，得到KEGG 富集分析具体通路信息，将得到的结果利用Perl 语言进行处理后，运用Cytoscape 3.7.2 构建“通路-关键靶点”关系网络，分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的“通路-关键靶点”之间的关系。
1.2.6 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的化学成分及作用机制的文献验证 通过使用检索词结合不同数据库的检索方式，检索以下3 个数据库：知网、万方和PubMed 数据库。中文检索词包括：“骨关节炎”“龟鹿二仙胶”“中医”“槲皮素”“山奈酚”等；英文检索词包括：“Osteoarthritis，Guilu Erxianjiao，quercetin，kaempferol”等，挖掘分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的相关成分与机制，为网络药理学所分析的结果提供文献验证。
1.3 主要观察指标 关键靶点的GO 和KEGG 富集结果；关键靶点在龟鹿二仙胶治疗骨关节炎相关通路中的分布情况。
2 结果 Results
2.1 活性成分筛选及靶点筛选 共得到活性化合物95 个，其中龟板胶19 个，鹿角胶13 个，人参22 个，枸杞45 个；共有对应疾病靶点3 493 个，见表2。利用Perl 语言将上述数据进行综合处理后得到2 163 个药物对应靶点。
表2 ｜龟鹿二仙胶“中药-活性成分-疾病靶点”信息Table 2 ｜Information of “Chinese medicine-active component-disease target” forGuilu Erxianjiao序号 中药 活性成分(个) 疾病靶点(个)1 龟板胶 19 707 2 鹿角胶 13 836 3 人参 22 748 4 枸杞 45 1 202
2.2 疾病靶点筛选结果 将所得结果进行综合删除重复项后，得到骨关节炎相关靶点2 612 个。
2.3 网络构建与结果分析 得到201个共有靶点，对应龟鹿二仙胶活性成分69 个。利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“中药-活性成分-疾病靶点”网络图见图1。靶点数排名前8 位的成分为槲皮素(quercetin)、碳酸钙(calcium Carbonate)、山 奈 酚(kaempferol)、甘氨酸(glycine)、大豆黄素(glycitein)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、丙氨酸(alanine)和原阿片碱(fumarine)，见表3，这些可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的有效成分。将映射所得的201 个靶点利用String 构建PPI 网络，其产生相互作用的网络有201 个节点，3 543 条边，所得PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2 软件，使用Cyto
nCA 插件进行拓扑分析，得到20 个靶点的网络，见图2。对这20 个靶点进行分析，明确此20 个靶点的基本功能信息，见表4。将这20 个靶点所对应的成分进行网络构建得到图3 所示网络，根据degree 值大小筛选前8位的成分为槲皮素、山奈酚、人参皂苷Rh2、β-谷甾醇、大豆黄素、原阿片碱、碳酸钙和花生四烯酸盐，结合前面所得到的前8 位成分取交集后得到槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、大豆黄素、原阿片碱和碳酸钙6 个成分，提示这6 个成分可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键成分。
表3 ｜龟鹿二仙胶靶点数排名前8 位成分信息Table 3 ｜Information of top eight ingredients according to the target number ofGuilu Erxianjiao序号 化学成分 靶点数 来源中药1 槲皮素(Quercetin) 97 枸杞2 碳酸钙(Calcium carbonate) 52 龟板胶、鹿角胶3 山奈酚(Kaempferol) 37 人参4 甘氨酸(Glycine) 21 龟板胶、鹿角胶5 大豆黄素(Glycitein) 16 枸杞6 B-谷甾醇(B-Sitosterol) 15 人参、枸杞7 丙氨酸(Alanine) 13 龟板胶、鹿角胶8 原阿片碱(Fumarine) 11 人参
2.4 GO 富集分析 将2.3 中得到的20 个靶点利用R 语言软件借助Bioconductor数 据 包library(org.Hs.eg.db) 对 这20 个靶点进行ID 转换，然后运用R 语言进行GO 分析得到1 550 个条目，其中生物学过程占1 512 个，分子生物学功能占21 个，细胞组分占17 个，显示龟鹿二仙胶治疗骨关节炎主要与对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对活性氧的反应及细胞蛋白质定位建立的正调控等生物学过程以及生长因子受体结合、丝裂原活化蛋白激酶活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子生物学功能密切相关，其过程涉及细胞内囊泡、膜筏、膜微区、内质网腔及核染色质等细胞组分。其主要生物学过程、分子生物学功能、细胞组分参与的基因见表5-7。
表4 ｜关键靶点基因功能信息Table 4 ｜Functio
nal information of key target genes序号 靶点基因 靶向蛋白 靶向蛋白的生物学活性1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 参与核事件，包括转录，RNA 运输，DNA 复制和凋亡2 白细胞介素6(IL-6) Interleukin-6 具有多种生物学功能的细胞因子，急性时相反应的一种强力诱导剂3 蛋白激酶1(AKT1) RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 调控新陈代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成4 胰岛素(INS) Insulin 增加细胞对单糖、氨基酸和脂肪酸的通透性5 血管内皮生长因子A(VEGFA) Vascular endothelial growth factor A 诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制凋亡，诱导血管通透性6 转录因子AP-1(JUN) Trans
cription factor AP-1 转录因子识别和结合增强子七肽基序5‘-TGA[CG]TCA-3’7 表皮生长因子受体(EGFR) Epidermal growth factor receptor 将细胞外信号转化为适当的细胞反应8 基质金属蛋白酶9(MMP9) Matrix me
talloproteinase-9 基质金属蛋白酶9，在细胞外基质的局部蛋白分解和白细胞迁移中起重要作用9 表皮生长因子(EGF) Pro-epidermal growth factor 体内和体外刺激各种表皮和上皮组织的生长，在细胞培养中刺激部分成纤维细胞生长10 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(CASP3)Caspase-3 参与负责凋亡执行的caspase 的激活级联11 丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1) Mitogen-activated protein kinase 1 是MAP 激酶信号转导通路的重要组成部分12 前列腺素G/H 合酶2(PTGS2) Prostaglandin G/H synthase 2 将花生四烯酸转化为前列腺素H2(PGH 2)13 原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC) Proto-o
ncogene tyrosine-protein kinase 参与基因转录、免疫反应、细胞粘附、细胞周期进展、凋亡、迁移和转化14 丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8) Mitogen-activated protein kinase 8 参与细胞增殖、分化、迁移、转化和程序性细胞死亡等多种过程15 白细胞介素1β(IL-1β) Interleukin-1 beta 强效促炎细胞因子16 原癌基因蛋白(MYC) proto-o
ncogene protein 激活生长相关基因的转录，与VEGFA 启动子结合，促进VEGFA 的产生和随后的血管生成17 C 基序趋化因子2(CCL2) C-C motif chemokine 2 趋化因子，能吸引单核细胞和嗜碱性细胞，增强单核细胞抗肿瘤活性18 72 kDa IV 型胶原酶(MMP2) 72 kDa type IV collagenase 参与血管重塑、血管生成、组织修复、肿瘤侵袭、炎症和动脉粥样硬化斑块破裂等多种功能19 雌激素受体(ESR1) Estrogen receptor 参与调控真核细胞基因的表达，影响靶细胞的增殖和分化20 丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14) Mitogen-activated protein kinase 14 刺激诱发的细胞外刺激，诱导转录因子直接激活
表5 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要生物学过程Table 5 ｜The main biological processes involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 生物学过程 基因数 相关基因1 对氧化应激的反应(Respo
nse To Oxidative Stress)12 IL-6，AKT1，INS，JUN，EGFR，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，MMP2 2 对脂多糖的反应(Respo
nse To Lipopolysaccharide)11 IL-6，AKT1，JUN，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 3 对细菌源分子的反应(Respo
nse To Molecule Of Bacterial Origin)11 IL-6，AKT1，JUN，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 4 对活性氧的反应(Respo
nse To Reactive Oxygen Species)10 IL-6，AKT1，JUN，EGFR，MMP9，CASP3，MAPK1，SRC，MAPK8，MMP2 5 蛋白质定位建立的正向调控(Positive Regulation Of Establishment Of Protein Localization)10 AKT1，INS，EGFR，EGF，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，MAPK14
表6 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要分子生物学功能Table 6 ｜The main molecular biological functions involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 分子生物学功能 基因数 相关基因1 生长因子受体结合(Growth Factor Receptor Binding) 5 IL-6，VEGFA，EGF，SRC，IL1B 2 丝裂原活化蛋白激酶活性(MAP Kinase Activity) 3 MAPK1，MAPK8，MAPK14 3 受体配体活性(Receptor Ligand Activity) 6 IL-6，INS，VEGFA，EGF，IL1B，CCL2 4 细胞因子受体结合(Cytokine Receptor Binding) 5 IL-6，VEGFA，CASP3，IL1B，CCL2 5 蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(Protein Serine/Threo
nine Kinase Activity)3 AKT1，MAPK1，MAPK14
表7 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要细胞组分Table 7 ｜The main cellular compo
nents involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 细胞组分 基因数 相关基因1 囊泡腔(Vesicle Lumen) 6 INS，VEGFA，EGFR，EGF，MAPK1，MAPK14 2 膜筏(Membrane Raft) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC 3 膜微区(Membrane Microdomain) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC 4 分泌颗粒腔(Secretory Granule Lumen) 5 INS，VEGFA，EGF，MAPK1，MAPK14 5 膜区(Membrane Region) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC
2.5 KEGG 富集分析及“通路-关键靶点”关系网络 构建KEGG 分析结果见图3，共得到138 条通路，将这138 条通路信息利用Perl 语言进行处理后，将所得数据导入Cytoscape 3.7.2 软件构建“通路-关键靶点”关系网络见图4，根据degree 值并排除宽泛通路后筛选出13 条主要通路，具体主要通路和其涉及基因见表8。
2.6 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的化学成分及作用机制的文献验证 通过检索共纳入文献17 篇[8-11,19-31]。分析所得文献，明晰龟鹿二仙胶的功用主治和方中单味药的功效，以及此方治疗骨关节炎的中医认识及作用机制，见图5。文献报道龟鹿二仙胶全方、拆方及其单药中主要化学成分槲皮素、山奈酚和甘氨酸等对骨关节炎均具有治疗作用[8-11,19-26]；大豆黄素可能通过对成骨细胞的增殖作用，抑制破骨性骨吸收，防治骨关节炎的发生和进展[27-28]；人参皂苷能通过增高Bcl-2/Bax 的比值、提高软骨细胞中Ⅱ型胶原基因的表达、抑制基质金属蛋白酶13 的表达来改善骨关节炎患者症状[29-31]。其治疗骨关节炎的机制主要与对炎症介质、基质金属蛋白酶表达量和Ⅱ型胶原基因的调控相关，说明龟鹿二仙胶治疗骨关节炎可能与炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等通路有关。
表8 ｜龟鹿二仙胶与骨关节炎关键靶点通路分析结果Table 8 ｜Key target pathway analysis ofGuilu Erxianjiaorelated to osteoarthritis序号ID 通路 基因数 关键基因分布1 Hsa04010 丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK Signaling Pathway) 12 AKT1，INS，VEGFA，JUN，EGFR，EGF，CASP3，MAPK1，MAPK8，IL1B，MYC，MAPK14 2 Hsa04933 糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE Signaling Pathway In Diabetic Complications)11 IL-6，AKT1，VEGFA，JUN，CASP3，MAPK1，MAPK8，IL1B，CCL2，MMP2，MAPK14 3 Hsa04668 肿瘤坏死因子信号通路(TNF Signaling Pathway) 11 IL-6，AKT1，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 4 Hsa04657 白细胞介素17 信号通路(IL-17 Signaling Pathway) 10 IL-6，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 5 Hsa01522 内分泌抗性(Endocrine Resistance) 10 AKT1，JUN，EGFR，MMP9，MAPK1，SRC，MAPK8，MMP2，ESR1，MAPK14 6 Hsa05418 流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid Shear Stress And Atherosclerosis)10 AKT1，VEGFA，JUN，MMP9，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MMP2，MAPK14 7 Hsa05161 乙型肝炎(Hepatitis B) 10 IL-6，AKT1，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，SRC，MAPK8，MYC，MAPK14 8 Hsa04625 C-凝集素受体信号通路(C-Type Lectin Receptor Signaling Pathway)9 IL-6，AKT1，JUN，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，MAPK14 9 Hsa04066 低氧诱导因子1 信号通路(HIF-1 Signaling Pathway) 8 GAPDH，IL-6，AKT1，INS，VEGFA，EGFR，EGF，MAPK1 10 Hsa04068 叉头框转录因子O 信号通路(FOXO Signaling Pathway) 8 IL-6，AKT1，INS，EGFR，EGF，MAPK1，MAPK8，MAPK14 11 Hsa04915 雌激素信号通路(Estrogen Signaling Pathway) 8 AKT1，JUN，EGFR，MMP9，MAPK1，SRC，MMP2，ESR1 12 Hsa04620 Toll 样受体信号通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway) 7 IL-6，AKT1，JUN，MAPK1，MAPK8，IL1B，MAPK14 13 Hsa04370 血管内皮生长因子信号通路(VEGF Signaling Pathway) 6 AKT1，VEGFA，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK14
3 讨论 Discussion
中医学认为骨关节炎属“痹证”和“骨痹”范畴。骨痹的病因多考虑为外感风邪，遇寒或受热，加之湿邪偏盛，诸邪裹结，合而为痹。而素体骨髓亏虚，肌腠不能抵御邪气，外邪乘隙入侵，是导致骨痹发生的内在因素。中医治疗骨痹讲究辨证论治，旨在通过中草药的配伍，以达到通络止痛、补虚泻实之功效。龟鹿二仙胶方中的龟板胶入肝、肾、肺三经，有滋阴潜阳和益肾健骨之用；鹿角胶归经肝肾，能温补肝肾和益精养血；人参入脾、肺、心经，有大补元气之功；枸杞入肝、肾经，能治肝肾亏虚、腰膝酸软之症。四药合用，能对肾元虚损和精血不足所致的筋骨形体失养从根本上进行治疗。
网络药理学能够从中药成分、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发进行研究，特别适宜研究中药“多成分-多靶点-多途径”的作用关系，探明中药的药效物质基础及具体作用机制。文章基于网络药理学方法分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎“化学成分-靶点-通路”之间的关系，探讨了其潜在作用机制。文章通过富集分析得出了龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的主要成分有69个，其中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等成分可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键成分；主要治疗靶点有201 个，其中的白细胞介素6、丝裂原活化蛋白激酶1 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 等20 个靶点为核心靶点。
在骨关节炎发展过程中，炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖几种因素是密切关联的，炎症可以导致软骨组织细胞外基质的降解，也可以通过线粒体依赖途径、内质网应激途径以及死亡受体介导的细胞信号转导途径引起软骨细胞凋亡[32]。在龟鹿二仙胶治疗骨关节炎所针对的核心靶点中，白细胞介素1β 由关节中的软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和滑膜细胞、浸润滑膜的免疫细胞等产生[33]，能强烈诱导蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶)的表达和释放，并抑制细胞外基质的表达，包括Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖[34]，它还与其他细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1 和趋化因子2 起协同作用，进一步增强炎症反应。此外，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶能调控新陈代谢、细胞增殖、细胞存活、生长和血管生成等过程，这些功能是丝氨酸、苏氨酸单独或者联合通过磷酸化一系列下游底物来介导的，如miR-543能够提升蛋白激酶和B 淋巴细胞瘤-2 基因表达水平，使软骨细胞的增殖得到提升，有效对抗白细胞介素1β 诱导引发的软骨细胞损伤[35-36]。分析以上结果可知，龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用与调控炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等因素密切相关。
KEGG 富集分析结果显示，龟鹿二仙胶防治骨关节炎可能主要通过调控丝裂原活化蛋白激酶、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体、叉头框转录因子O 和低氧诱导因子1 等13 条信号通路发挥作用。其中丝裂原活化蛋白激酶信号通路与骨关节炎软骨损伤具有重要联系，它的激活能调控炎症反应、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等多种生物学反应。研究证实，上调miR-24 下调C-myc可以通过失活丝裂原活化蛋白激酶信号通路来抑制软骨细胞凋亡并促进软骨细胞增殖，进而阻止骨关节炎的发生和发展[37]。
图1 ｜“中药-活性成分-疾病靶点”网络Figure 1 ｜Network of “Chinese medicine-active ingredients-disease target”图注：图中蓝色三角形表示疾病靶点，左上淡绿色椭圆形表示龟板胶的活性成分，右上紫红色椭圆形表示鹿角胶活性成分，中上相交黄色椭圆形表示龟板胶和鹿角胶共有活性成分；左下红色椭圆形表示枸杞的活性成分，右下深绿色椭圆形表示人参的活性成分，下中相交黄色椭圆形表示枸杞和人参的共有活性成分
图2 ｜ 龟鹿二仙胶作用靶点PPI 网络(A)及PPI 网络筛选(B)Figure 2 ｜Protein-protein interaction network(A) and protein-protein interaction network screening (B) ofGuilu Erxianjiao图注：图A 中的圆点表示龟鹿二仙胶的作用靶点，每一条边表示靶点间相互作用关系；借助Cytoscape 3.7.2 软件中的Cyto
nCA 插件对图A进行筛选，得到图B 网络，蓝色方框内为关键靶点，每条线代表靶点间的相互作用关系，说明这些靶点为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的主要作用靶点
图3 ｜ “筛选靶点-成分 ”网络Figure 3 ｜ Screening target-compo
nent network图注：图中蓝色三角形表示20 个关键靶点，青色椭圆形表示这些关键靶点所对应的药物活性成分；每条边表示药物活性成分和靶点之间的关联程度，边数越多，表示两者关联程度越高
图4 ｜ “通路-关键靶点 ”网络Figure 4 ｜ Pathway-key target network图注：图中红色菱形表示关键靶点；紫色倒尖角形状表示作用通路，形状越大表示通路涉及的关键靶点越多。每条边表示关键靶点与通路之间的关系
图5 ｜ 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的相关分析Figure 5 ｜ Correlation analysis ofGuilu Erxianjiaoin the treatment of osteoarthritis
正常的关节软骨是一个低氧组织，作为对低氧反应的主要调节因子，低氧诱导因子1α 能显著调节骨的发育和重建，在软骨细胞生长和分化过程中具有关键作用，软骨缺乏低氧诱导因子1α能导致大量软骨细胞死亡[38-39]。马笃军等[40]用牛膝总皂苷干预兔骨关节炎模型，发现低氧诱导因子1 信号通路在实验兔骨关节炎模型软骨修复过程中发挥了较大作用。有研究发现晚期糖基化终末产物如戊糖素在关节软骨中的含量随着年龄增长而增加，而戊糖素含量与关节软骨的胶原网络脆性具有较高联系性；此外，软骨与另一些晚期糖基化终末产物如苏阿糖等发生糖化作用后，胶原网络的刚性会发生增长，且增长幅度与晚期糖基化终末产物含量呈高相关性；胶原网络两种特性的增加则会提升其易感性，关节软骨更易发生机械损伤[41]。糖基化终末产物受体与晚期糖基化终末产物结合可以引发一系列病变，机制十分复杂。研究表明，糖基化终末产物受体与衰老、慢性炎症及细胞应激有密切联系，在细胞稳态及损伤后修复等过程中都有参与[42]。
目前，中医药防治骨关节炎的临床研究和动物实验很多，但是明确针对晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路的研究仍然较少，晚期糖基化终末产物作为衰老导致骨关节炎发生的一个重要因素，中医药通过调控此信号通路防治骨关节炎的具体作用机制仍待进一步研究。此外，肥胖因素已成为骨关节炎患者大量增加的一个重要原因之一，肥胖导致的慢性轻度炎症与骨关节炎进程密切相关。
Toll 样受体是一类非特异性免疫受体，其家族成员Toll 样受体4 在肥胖相关的骨关节炎进程中有至关重要的作用，阻断Toll 样受体4 信号通路即可起到治疗肥胖相关骨关节炎的作用[43]，但是目前对中医药防治肥胖相关骨关节炎的研究相对较少，因此可以进一步开展相关研究。
文章运用网络药理学的研究技术预测了龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的潜在活性成分、关键靶点及其作用途径网络，为更深入地探讨其作用机制以及更广泛地应用于临床提供了一定依据。另一方面以文献挖掘得出的信息进行比对，得出对此次龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用靶点、作用网络具有一定的预测性和准确性，但是在预测结果中仍有部分活性成分、靶点及作用网络的临床及基础验证不足，在后期可对这些活性成分、靶点及作用网络进行进一步验证，为临床的应用服务提供更充足的证据。
作者贡献：实验设计由第一作者完成，文献收集与修改校正由其他作者共同完成。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81973880)、福建省自然科学基金面上项目(2019J01349)”的基金资助，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。
4 参考文献 References
[1] SILVERWOOD V, BLAGOJEVIC-BUCKNALL M, JINKS C, et al. Current evidence on risk factors for knee osteoarthritis in older adults: a systematic review and me
taanalysis. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(4):507-515.
[2] LANE NE, BRANDT K, HAWKER G, et al. OARSIFDA initiative: defining the disease state of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2011;19(5):478-482.
[3] 中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)[J].康复学报,2019,29(3):1-7.
[4] 林嘉辉,陈炳艺,李楠.龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的研究概况[J].中华中医药杂志,2017,32(12):5509-5512.
[5] 姜灵.龟鹿二仙胶汤治疗肝肾亏虚型膝关节骨性关节炎的临床疗效研究[D].大连:大连医科大学,2016.
[6] 刘俊锋.龟鹿二仙胶汤对膝骨关节炎早期干预的临床研究[D].成都:成都中医药大学,2013.
[7] 张农.龟鹿二仙胶治疗老年增生性骨关节炎的临床观察[J].中医临床研究,2012,4(13):79-80.
[8] 余添赐.龟鹿二仙胶不同提取部位对体外培养豚鼠关节软骨细胞活性的影响[D].福州:福建中医药大学,2014.
[9] 李楠,杜江,黄远鹏,等.龟鹿二仙胶及其拆方对SD 大鼠膝骨关节炎的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(6):1677-1680.
[10] 杜江,黄远鹏,李奕修,等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响[J].中医正骨,2013,25(3):11-20.
[11] 杜江,黄远鹏,李奕修,等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠关节软骨中Bax和Bcl-2 的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2013,21(3):4-7.
[12] 刘艾林,杜冠华.网络药理学:药物发现的新思想[J].药学学报,2010,45(12):1472-1477.
[13] 许海玉,黄璐琦,卢鹏,等.基于体内ADME过程和网络药理学的中药现代研究思路[J].中国中药杂志,2012,37(2):142-145.
[14] XU X, ZHANG W, HUANG C, et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 2012;13(6):6964-6982.
[15] LI J, ZHAO P, LI Y, et al. Systems pharmacologyba
sed dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chro
nic obstructive pulmo
nary disease. Sci Rep. 2015;5(1):15290.
[16] 侯磊,李晓宇,黄娜娜,等.四逆散干预焦虑症作用机制的网络药理学分析[J].中草药,2019,50(21):5154-5161.
[17] SZKLARCZYK D, MORRIS J H, COOK H, et al. The STRING databa
se in 2017: quality-co
ntrolled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D362-D368.
[18] 张新雨,黄娜娜,孙凯滨,等.柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压作用网络与机制预测[J].中草药,2019,50(21):5162-5169.
[19] KANZAKI N, SAITO K, MAEDA A, et al. Effect of a dietary supplement co
ntaining glucosamine hydrochloride, cho
ndroitin sulfate and quercetin glycosides on symptomatic knee osteoarthritis: a randomized, double-blind,placebo-co
ntrolled study. J Sci Food Agric.2012;92(4):862-869.
[20] LEYVA-LOPEZ N, GUTIERREZ-GRIJALVA E P, AMBRIZ-PEREZ D L, et al. Flavo
noids as cytokine modulators: a possible therapy for inflammation-related diseases. Int J Mol Sci.2016;17(6):921.
[21] QIU L, LUO Y, CHEN X. Quercetin attenuates mitocho
ndrial dysfunction and biogenesis via upregulated AMPK/SIRT1 signaling pathway in OA rats. Biomed Pharmacother.2018;103:1585-1591.
[22] BRITTI D, CRUPI R, IMPELLIZZERI D, et al. A novel composite formulation of palmitoylethanolamide and quercetin decreases inflammation and relieves pain in inflammatory and osteoarthritic pain models.BMC Vet Res. 2017;13(1): 229.
[23] HALEAGRAHARA N, HODGSON K, MIRANDAHERNANDEZ S, et al. Flavo
noid quercetinmethotrexate combination inhibits inflammatory mediators and matrix me
talloproteinase ex
pression, providing protection to joints in collagen-induced arthritis. Inflammopharmacology. 2018;26(5):1219-1232.
[24] HU Y, GUI Z, ZHOU Y, et al. Quercetin alleviates rat osteoarthritis by inhibiting inflammation and apoptosis of chondrocytes, modulating synovial macrophages polarization to M2 macrophages. Free Radic Biol Med. 2019;145:146-160.
[25] ZHUANG Z, YE G, HUANG B. Kaempferol Alleviates the Interleukin-1beta-Induced Inflammation in Rat Osteoarthritis Cho
ndrocytes via Suppression of NF-kappaB.Med Sci Monit. 2017;23:3925-3931.
[26] DE PAZ-LUGO P, LUPIANEZ JA, MELENDEZHEVIA E. High glycine co
ncentration increases collagen synthesis by articular cho
ndrocytes in vitro: acute glycine deficiency could be an im
portant cause of osteoarthritis. Amino Acids.2018,50(10):1357-1365.
[27] 王志平,禹博,刘明皓,等.大豆苷元对人成骨细胞经典的雌激素受体信号通路的调节作用[J].武警后勤学院学报(医学版),2018,27(3):200-203.
[28] 王健,陶海荣.雌激素及相关化合物干预骨关节炎作用机制:关节保护与骨软骨细胞的修复[J].中国组织工程研究,2014,18(33):5372-5376.
[29] 黎立,李晓旭,司裕,等.人参皂苷Rb2 保护关节软骨细胞对抗氧化应激的作用机制研究[J].中国矫形外科杂志,2018,26(9):845-849.
[30] WANG W, ZENG L, WANG ZM, et al. Ginsenoside Rb1 inhibits matrix me
talloproteinase 13 through down-regulating Notch signaling pathway in osteoarthritis. Exp Biol Med(Maywood). 2015;240(12):1614-1621.
[31] 段超.人参皂苷Rg1 防治兔膝关节骨性关节炎的实验研究[D].武汉:湖北中医药大学,2016.
[32] 黄威,尹宗生.炎症与骨关节炎软骨退变[J].中国矫形外科杂志,2019,27(5):448-452.
[33] SOHN DH, SOKOLOVE J, SHARPE O, et al.Plasma proteins present in osteoarthritic synovial fluid can stimulate cytokine production via Toll-like receptor 4. Arthritis Res Ther. 2012;14(1):R7.
[34] CHOCKALINGAM PS, VARADARAJAN U,SHELDON R, et al. Involvement of protein kinase Czeta in interleukin-1beta induction of ADAMTS-4 and type 2 nitric oxide synthase via NF-kappaB signaling in primary human osteoarthritic chondrocytes. Arthritis Rheum.2007;56(12):4074-4083.
[35] 陈喜德,魏波,杨柳菁,等.不同病期骨关节炎大鼠关节软骨中caspase-3 与细胞凋亡的相关性[J].广东医学,2018,39(2):181-186.
[36] 冯顶丽,卓丽丹,芦笛,等.微小RNA 调节间充质干细胞软骨分化机制的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2018,45(6):640-645.
[37] WU Y H, LIU W, ZHANG L, et al. Effects of microRNA-24 targeting C-myc on apoptosis,proliferation, and cytokine ex
pressions in cho
ndrocytes of rats with osteoarthritis via MAPK signaling pathway. J Cell Biochem. 2018;119(10):7944-7958.
[38] 邵进,张岩,王治,等.低氧诱导因子-1α 参与骨发育及骨代谢调控的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2015,21(3):349-355.
[39] 田大川,李海乐,肖大伟,等.联合应用软骨再生支架与突变型HIF-1α 修饰BMSCs 分泌的外泌体对晚期软骨缺损修复的促进作用[J].吉林大学学报(医学版),2018,44(2):216-222.
[40] 马笃军,彭力平,余阗,等.牛膝总皂苷对骨关节炎模型兔软骨修复及低氧诱导因子1 信号通路的影响[J].中国组织工程研究,2019,23(27):4332-4337.
[41] 孙志江.自噬在晚期糖基化终产物诱导的软骨细胞凋亡中的作用[D].兰州:兰州大学,2018.
[42] SORCI G, RIUZZI F, GIAMBANCO I, et al. RAGE in tissue homeostasis, repair and regeneration.Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Mol Cell Res. 2013;1833(1):101-109.
[43] 徐小磊.TLR4/Akt/FoxO1 轴在白藜芦醇抗肥胖相关骨性关节炎中的作用研究[D].沈阳:中国医科大学,2019.
0 引言 Introduction骨关节炎是最常见的关节疾病，是导致残疾的主要原因。个体遗传易感性、衰老、肥胖和关节排列不良等几个危险因素与骨关节炎密切相关[1-2]。在中医学中并无骨关节炎的病名，但据其临床表现可归属于中医学骨痹范畴，《中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)》将其分为肝肾亏虚、气血虚弱、寒湿痹阻、湿热痹阻及气滞血瘀共5 个证型，其治疗原则多为滋补肝肾、补气养血、温经散寒、清热除湿和活血化瘀等[3]。目前骨关节炎的诊断仅是基于临床症状和影像学标准，病因至今未明，为骨伤科治疗难题之一，因此，亟需探明有效的骨关节炎防治策略。因中医药治疗骨关节炎的不良反应较小，临床疗效肯定，近年来研究者对中药复方治疗骨关节炎作用机制的探究也越来越多。龟鹿二仙胶最早见于《医便》，由龟板胶、鹿角胶、人参和枸杞组成，诸药合用，共奏补益肝肾、填精益髓及助阳益气之功[4]。临床研究表明龟鹿二仙胶方治疗骨关节炎效果显著，能明显改善患者的临床症状[5-7]。此外，龟鹿二仙胶防治骨关节炎的作用机制也取得了一定的进展，研究表明龟鹿二仙胶能抑制软骨细胞凋亡、延缓软骨外基质降解及减少炎症因子表达[8-11]，但由于龟鹿二仙胶复方成分较复杂，其作用于骨关节炎的具体机制仍缺乏有力证据证明。网络药理学集合了数据挖掘、靶点预测和高通量数据整合等多种研究方法，它把中药成分靶点间的相互作用和联系系统的展现出来，还能整体分析中药复方多成分的作用机制，其系统性和整体性与中医药辨证论治、整体观念的原则具有很大程度的一致性，深入推动了中药复方药效分子机制的研究[12-13]。文章基于网络药理学，通过数据挖掘与分析，筛选和系统预测龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的潜在作用靶点和信号通路，为龟鹿二仙胶临床精准定位提供药理学依据，为进一步的基础研究以及临床应用提供了新的思路与线索。1 资料和方法 Data and methods1.1 数据库、软件及分析平台 作者于2020 年2 月至5 月运用生物信息学和数据挖掘技术检索以下10 个数据库的文献，见表1。1.2 分析方法1.2.1 龟鹿二仙胶活性成分的获取及靶点筛选 利用TCMSP，BATMAN-TCM和TCMID 数据库收集龟鹿二仙胶中龟板胶、鹿角胶、人参及枸杞的化学成分，基于口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 进行筛选[14-15]，同时查阅文献对未纳入数据库但已报道具生物活性和药理作用的也一并纳入，最终确定其活性成分。通过 TCMSP 和Drug Bank 数据库查询活性成分相对应的靶标蛋白，并利用 Unitprot 数据库查询靶标蛋白对应的基因名称，剔除非人类的靶点蛋白[16]，最终整理得到龟鹿二仙胶的活性成分及其对应靶点。1.2.2 骨关节炎靶点筛选预测 利用GeneCards 和OMIM 数 据 库， 以“osteoarthritis”为关键词，对骨关节炎相关靶点进行检索及筛选，将所有筛选结果合并去重后得到骨关节炎的相关靶标信息。1.2.3 网络构建与分析 利用Perl 语言将所得药物活性成分靶点与骨关节炎疾病靶点相映射，得到龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的预测靶点。将交集得到的靶点导入String 数据库[17]，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并用Cytoscape 3.7.2软件中的Cyto
nCA 插件对所得的蛋白质相互作用网络数据进行分析，借助度中心性(DC)和介度中心性(BC)指标进行筛选，首先筛选大于2 倍中位数的度中心性值的节点，筛选完成后根据初筛结果继续筛选大于每个指标所对应的中位数的节点[18]，得到龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键靶点。表1 ｜数据库及软件Table 1 ｜Databa
ses and software序号 数据库及软件名称 网址1 中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP) http: //lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php 2 中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM) http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/3 中医药综合数据库(TCMID) http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx 4 Drug Bank 数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 5 Unitprot 数据库 http://www.Unitprot.org/6 cytoscape 3.6.2 软件 https://cytoscape.org/7 蛋白质相互作用数据库(STRING) https://string-db.org/8 真核生物基因组自动注释数据库(Ensembl) http://asia.ensembl.org/index.html 9 GeneCards 数据库 https://www.genecards.org 10 OMIM 数据库 https://www.omim.org/1.2.4 基因本体论(gene ontology，GO)富集分析 首先，使用R 语言(版本3.6.2)软件将龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的靶点进行ID 转换，为下一步做基础；其次，在R 语言中调用生物类的程序包，如clusterProfiler，bioco
nductor 等对关键靶点进行GO 富集分析(P＜ 0.05)，得到GO 富集分析结果，其中包括龟鹿二仙胶治疗骨关节炎靶点的生物学过程(biological process，BP)、分子生物学功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)等具体数据，通过对基因的富集分析预测龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的可能机制。1.2.5 京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)富集分析及KEGG 关系网络的构建 使用R 语言对关键靶点进行KEGG富集分析(P＜ 0.05)，得到KEGG 富集分析具体通路信息，将得到的结果利用Perl 语言进行处理后，运用Cytoscape 3.7.2 构建“通路-关键靶点”关系网络，分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的“通路-关键靶点”之间的关系。1.2.6 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的化学成分及作用机制的文献验证 通过使用检索词结合不同数据库的检索方式，检索以下3 个数据库：知网、万方和PubMed 数据库。中文检索词包括：“骨关节炎”“龟鹿二仙胶”“中医”“槲皮素”“山奈酚”等；英文检索词包括：“Osteoarthritis，Guilu Erxianjiao，quercetin，kaempferol”等，挖掘分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的相关成分与机制，为网络药理学所分析的结果提供文献验证。1.3 主要观察指标 关键靶点的GO 和KEGG 富集结果；关键靶点在龟鹿二仙胶治疗骨关节炎相关通路中的分布情况。2 结果 Results2.1 活性成分筛选及靶点筛选 共得到活性化合物95 个，其中龟板胶19 个，鹿角胶13 个，人参22 个，枸杞45 个；共有对应疾病靶点3 493 个，见表2。利用Perl 语言将上述数据进行综合处理后得到2 163 个药物对应靶点。表2 ｜龟鹿二仙胶“中药-活性成分-疾病靶点”信息Table 2 ｜Information of “Chinese medicine-active component-disease target” forGuilu Erxianjiao序号 中药 活性成分(个) 疾病靶点(个)1 龟板胶 19 707 2 鹿角胶 13 836 3 人参 22 748 4 枸杞 45 1 2022.2 疾病靶点筛选结果 将所得结果进行综合删除重复项后，得到骨关节炎相关靶点2 612 个。2.3 网络构建与结果分析 得到201个共有靶点，对应龟鹿二仙胶活性成分69 个。利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“中药-活性成分-疾病靶点”网络图见图1。靶点数排名前8 位的成分为槲皮素(quercetin)、碳酸钙(calcium Carbonate)、山 奈 酚(kaempferol)、甘氨酸(glycine)、大豆黄素(glycitein)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、丙氨酸(alanine)和原阿片碱(fumarine)，见表3，这些可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的有效成分。将映射所得的201 个靶点利用String 构建PPI 网络，其产生相互作用的网络有201 个节点，3 543 条边，所得PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2 软件，使用Cyto
nCA 插件进行拓扑分析，得到20 个靶点的网络，见图2。对这20 个靶点进行分析，明确此20 个靶点的基本功能信息，见表4。将这20 个靶点所对应的成分进行网络构建得到图3 所示网络，根据degree 值大小筛选前8位的成分为槲皮素、山奈酚、人参皂苷Rh2、β-谷甾醇、大豆黄素、原阿片碱、碳酸钙和花生四烯酸盐，结合前面所得到的前8 位成分取交集后得到槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、大豆黄素、原阿片碱和碳酸钙6 个成分，提示这6 个成分可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键成分。表3 ｜龟鹿二仙胶靶点数排名前8 位成分信息Table 3 ｜Information of top eight ingredients according to the target number ofGuilu Erxianjiao序号 化学成分 靶点数 来源中药1 槲皮素(Quercetin) 97 枸杞2 碳酸钙(Calcium carbonate) 52 龟板胶、鹿角胶3 山奈酚(Kaempferol) 37 人参4 甘氨酸(Glycine) 21 龟板胶、鹿角胶5 大豆黄素(Glycitein) 16 枸杞6 B-谷甾醇(B-Sitosterol) 15 人参、枸杞7 丙氨酸(Alanine) 13 龟板胶、鹿角胶8 原阿片碱(Fumarine) 11 人参2.4 GO 富集分析 将2.3 中得到的20 个靶点利用R 语言软件借助Bioconductor数 据 包library(org.Hs.eg.db) 对 这20 个靶点进行ID 转换，然后运用R 语言进行GO 分析得到1 550 个条目，其中生物学过程占1 512 个，分子生物学功能占21 个，细胞组分占17 个，显示龟鹿二仙胶治疗骨关节炎主要与对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对活性氧的反应及细胞蛋白质定位建立的正调控等生物学过程以及生长因子受体结合、丝裂原活化蛋白激酶活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子生物学功能密切相关，其过程涉及细胞内囊泡、膜筏、膜微区、内质网腔及核染色质等细胞组分。其主要生物学过程、分子生物学功能、细胞组分参与的基因见表5-7。表4 ｜关键靶点基因功能信息Table 4 ｜Functio
nal information of key target genes序号 靶点基因 靶向蛋白 靶向蛋白的生物学活性1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 参与核事件，包括转录，RNA 运输，DNA 复制和凋亡2 白细胞介素6(IL-6) Interleukin-6 具有多种生物学功能的细胞因子，急性时相反应的一种强力诱导剂3 蛋白激酶1(AKT1) RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 调控新陈代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成4 胰岛素(INS) Insulin 增加细胞对单糖、氨基酸和脂肪酸的通透性5 血管内皮生长因子A(VEGFA) Vascular endothelial growth factor A 诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制凋亡，诱导血管通透性6 转录因子AP-1(JUN) Trans
cription factor AP-1 转录因子识别和结合增强子七肽基序5‘-TGA[CG]TCA-3’7 表皮生长因子受体(EGFR) Epidermal growth factor receptor 将细胞外信号转化为适当的细胞反应8 基质金属蛋白酶9(MMP9) Matrix me
talloproteinase-9 基质金属蛋白酶9，在细胞外基质的局部蛋白分解和白细胞迁移中起重要作用9 表皮生长因子(EGF) Pro-epidermal growth factor 体内和体外刺激各种表皮和上皮组织的生长，在细胞培养中刺激部分成纤维细胞生长10 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(CASP3)Caspase-3 参与负责凋亡执行的caspase 的激活级联11 丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1) Mitogen-activated protein kinase 1 是MAP 激酶信号转导通路的重要组成部分12 前列腺素G/H 合酶2(PTGS2) Prostaglandin G/H synthase 2 将花生四烯酸转化为前列腺素H2(PGH 2)13 原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC) Proto-o
ncogene tyrosine-protein kinase 参与基因转录、免疫反应、细胞粘附、细胞周期进展、凋亡、迁移和转化14 丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8) Mitogen-activated protein kinase 8 参与细胞增殖、分化、迁移、转化和程序性细胞死亡等多种过程15 白细胞介素1β(IL-1β) Interleukin-1 beta 强效促炎细胞因子16 原癌基因蛋白(MYC) proto-o
ncogene protein 激活生长相关基因的转录，与VEGFA 启动子结合，促进VEGFA 的产生和随后的血管生成17 C 基序趋化因子2(CCL2) C-C motif chemokine 2 趋化因子，能吸引单核细胞和嗜碱性细胞，增强单核细胞抗肿瘤活性18 72 kDa IV 型胶原酶(MMP2) 72 kDa type IV collagenase 参与血管重塑、血管生成、组织修复、肿瘤侵袭、炎症和动脉粥样硬化斑块破裂等多种功能19 雌激素受体(ESR1) Estrogen receptor 参与调控真核细胞基因的表达，影响靶细胞的增殖和分化20 丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14) Mitogen-activated protein kinase 14 刺激诱发的细胞外刺激，诱导转录因子直接激活表5 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要生物学过程Table 5 ｜The main biological processes involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 生物学过程 基因数 相关基因1 对氧化应激的反应(Respo
nse To Oxidative Stress)12 IL-6，AKT1，INS，JUN，EGFR，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，MMP2 2 对脂多糖的反应(Respo
nse To Lipopolysaccharide)11 IL-6，AKT1，JUN，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 3 对细菌源分子的反应(Respo
nse To Molecule Of Bacterial Origin)11 IL-6，AKT1，JUN，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 4 对活性氧的反应(Respo
nse To Reactive Oxygen Species)10 IL-6，AKT1，JUN，EGFR，MMP9，CASP3，MAPK1，SRC，MAPK8，MMP2 5 蛋白质定位建立的正向调控(Positive Regulation Of Establishment Of Protein Localization)10 AKT1，INS，EGFR，EGF，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，MAPK14表6 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要分子生物学功能Table 6 ｜The main molecular biological functions involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 分子生物学功能 基因数 相关基因1 生长因子受体结合(Growth Factor Receptor Binding) 5 IL-6，VEGFA，EGF，SRC，IL1B 2 丝裂原活化蛋白激酶活性(MAP Kinase Activity) 3 MAPK1，MAPK8，MAPK14 3 受体配体活性(Receptor Ligand Activity) 6 IL-6，INS，VEGFA，EGF，IL1B，CCL2 4 细胞因子受体结合(Cytokine Receptor Binding) 5 IL-6，VEGFA，CASP3，IL1B，CCL2 5 蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(Protein Serine/Threo
nine Kinase Activity)3 AKT1，MAPK1，MAPK14表7 ｜龟鹿二仙胶治疗骨关节炎涉及的主要细胞组分Table 7 ｜The main cellular compo
nents involved in the treatment of osteoarthritis withGuilu Erxianjiao序号 细胞组分 基因数 相关基因1 囊泡腔(Vesicle Lumen) 6 INS，VEGFA，EGFR，EGF，MAPK1，MAPK14 2 膜筏(Membrane Raft) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC 3 膜微区(Membrane Microdomain) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC 4 分泌颗粒腔(Secretory Granule Lumen) 5 INS，VEGFA，EGF，MAPK1，MAPK14 5 膜区(Membrane Region) 5 EGFR，CASP3，MAPK1，PTGS2，SRC2.5 KEGG 富集分析及“通路-关键靶点”关系网络 构建KEGG 分析结果见图3，共得到138 条通路，将这138 条通路信息利用Perl 语言进行处理后，将所得数据导入Cytoscape 3.7.2 软件构建“通路-关键靶点”关系网络见图4，根据degree 值并排除宽泛通路后筛选出13 条主要通路，具体主要通路和其涉及基因见表8。2.6 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的化学成分及作用机制的文献验证 通过检索共纳入文献17 篇[8-11,19-31]。分析所得文献，明晰龟鹿二仙胶的功用主治和方中单味药的功效，以及此方治疗骨关节炎的中医认识及作用机制，见图5。文献报道龟鹿二仙胶全方、拆方及其单药中主要化学成分槲皮素、山奈酚和甘氨酸等对骨关节炎均具有治疗作用[8-11,19-26]；大豆黄素可能通过对成骨细胞的增殖作用，抑制破骨性骨吸收，防治骨关节炎的发生和进展[27-28]；人参皂苷能通过增高Bcl-2/Bax 的比值、提高软骨细胞中Ⅱ型胶原基因的表达、抑制基质金属蛋白酶13 的表达来改善骨关节炎患者症状[29-31]。其治疗骨关节炎的机制主要与对炎症介质、基质金属蛋白酶表达量和Ⅱ型胶原基因的调控相关，说明龟鹿二仙胶治疗骨关节炎可能与炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等通路有关。表8 ｜龟鹿二仙胶与骨关节炎关键靶点通路分析结果Table 8 ｜Key target pathway analysis ofGuilu Erxianjiaorelated to osteoarthritis序号ID 通路 基因数 关键基因分布1 Hsa04010 丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK Signaling Pathway) 12 AKT1，INS，VEGFA，JUN，EGFR，EGF，CASP3，MAPK1，MAPK8，IL1B，MYC，MAPK14 2 Hsa04933 糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE Signaling Pathway In Diabetic Complications)11 IL-6，AKT1，VEGFA，JUN，CASP3，MAPK1，MAPK8，IL1B，CCL2，MMP2，MAPK14 3 Hsa04668 肿瘤坏死因子信号通路(TNF Signaling Pathway) 11 IL-6，AKT1，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 4 Hsa04657 白细胞介素17 信号通路(IL-17 Signaling Pathway) 10 IL-6，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，PTGS2，MAPK8，IL1B，CCL2，MAPK14 5 Hsa01522 内分泌抗性(Endocrine Resistance) 10 AKT1，JUN，EGFR，MMP9，MAPK1，SRC，MAPK8，MMP2，ESR1，MAPK14 6 Hsa05418 流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid Shear Stress And Atherosclerosis)10 AKT1，VEGFA，JUN，MMP9，SRC，MAPK8，IL1B，CCL2，MMP2，MAPK14 7 Hsa05161 乙型肝炎(Hepatitis B) 10 IL-6，AKT1，JUN，MMP9，CASP3，MAPK1，SRC，MAPK8，MYC，MAPK14 8 Hsa04625 C-凝集素受体信号通路(C-Type Lectin Receptor Signaling Pathway)9 IL-6，AKT1，JUN，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK8，IL1B，MAPK14 9 Hsa04066 低氧诱导因子1 信号通路(HIF-1 Signaling Pathway) 8 GAPDH，IL-6，AKT1，INS，VEGFA，EGFR，EGF，MAPK1 10 Hsa04068 叉头框转录因子O 信号通路(FOXO Signaling Pathway) 8 IL-6，AKT1，INS，EGFR，EGF，MAPK1，MAPK8，MAPK14 11 Hsa04915 雌激素信号通路(Estrogen Signaling Pathway) 8 AKT1，JUN，EGFR，MMP9，MAPK1，SRC，MMP2，ESR1 12 Hsa04620 Toll 样受体信号通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway) 7 IL-6，AKT1，JUN，MAPK1，MAPK8，IL1B，MAPK14 13 Hsa04370 血管内皮生长因子信号通路(VEGF Signaling Pathway) 6 AKT1，VEGFA，MAPK1，PTGS2，SRC，MAPK143 讨论 Discussion中医学认为骨关节炎属“痹证”和“骨痹”范畴。骨痹的病因多考虑为外感风邪，遇寒或受热，加之湿邪偏盛，诸邪裹结，合而为痹。而素体骨髓亏虚，肌腠不能抵御邪气，外邪乘隙入侵，是导致骨痹发生的内在因素。中医治疗骨痹讲究辨证论治，旨在通过中草药的配伍，以达到通络止痛、补虚泻实之功效。龟鹿二仙胶方中的龟板胶入肝、肾、肺三经，有滋阴潜阳和益肾健骨之用；鹿角胶归经肝肾，能温补肝肾和益精养血；人参入脾、肺、心经，有大补元气之功；枸杞入肝、肾经，能治肝肾亏虚、腰膝酸软之症。四药合用，能对肾元虚损和精血不足所致的筋骨形体失养从根本上进行治疗。网络药理学能够从中药成分、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发进行研究，特别适宜研究中药“多成分-多靶点-多途径”的作用关系，探明中药的药效物质基础及具体作用机制。文章基于网络药理学方法分析龟鹿二仙胶治疗骨关节炎“化学成分-靶点-通路”之间的关系，探讨了其潜在作用机制。文章通过富集分析得出了龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的主要成分有69个，其中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等成分可能为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的关键成分；主要治疗靶点有201 个，其中的白细胞介素6、丝裂原活化蛋白激酶1 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 等20 个靶点为核心靶点。在骨关节炎发展过程中，炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖几种因素是密切关联的，炎症可以导致软骨组织细胞外基质的降解，也可以通过线粒体依赖途径、内质网应激途径以及死亡受体介导的细胞信号转导途径引起软骨细胞凋亡[32]。在龟鹿二仙胶治疗骨关节炎所针对的核心靶点中，白细胞介素1β 由关节中的软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和滑膜细胞、浸润滑膜的免疫细胞等产生[33]，能强烈诱导蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶)的表达和释放，并抑制细胞外基质的表达，包括Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖[34]，它还与其他细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1 和趋化因子2 起协同作用，进一步增强炎症反应。此外，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶能调控新陈代谢、细胞增殖、细胞存活、生长和血管生成等过程，这些功能是丝氨酸、苏氨酸单独或者联合通过磷酸化一系列下游底物来介导的，如miR-543能够提升蛋白激酶和B 淋巴细胞瘤-2 基因表达水平，使软骨细胞的增殖得到提升，有效对抗白细胞介素1β 诱导引发的软骨细胞损伤[35-36]。分析以上结果可知，龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用与调控炎症、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等因素密切相关。KEGG 富集分析结果显示，龟鹿二仙胶防治骨关节炎可能主要通过调控丝裂原活化蛋白激酶、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体、叉头框转录因子O 和低氧诱导因子1 等13 条信号通路发挥作用。其中丝裂原活化蛋白激酶信号通路与骨关节炎软骨损伤具有重要联系，它的激活能调控炎症反应、软骨代谢、细胞凋亡与增殖等多种生物学反应。研究证实，上调miR-24 下调C-myc可以通过失活丝裂原活化蛋白激酶信号通路来抑制软骨细胞凋亡并促进软骨细胞增殖，进而阻止骨关节炎的发生和发展[37]。图1 ｜“中药-活性成分-疾病靶点”网络Figure 1 ｜Network of “Chinese medicine-active ingredients-disease target”图注：图中蓝色三角形表示疾病靶点，左上淡绿色椭圆形表示龟板胶的活性成分，右上紫红色椭圆形表示鹿角胶活性成分，中上相交黄色椭圆形表示龟板胶和鹿角胶共有活性成分；左下红色椭圆形表示枸杞的活性成分，右下深绿色椭圆形表示人参的活性成分，下中相交黄色椭圆形表示枸杞和人参的共有活性成分图2 ｜ 龟鹿二仙胶作用靶点PPI 网络(A)及PPI 网络筛选(B)Figure 2 ｜Protein-protein interaction network(A) and protein-protein interaction network screening (B) ofGuilu Erxianjiao图注：图A 中的圆点表示龟鹿二仙胶的作用靶点，每一条边表示靶点间相互作用关系；借助Cytoscape 3.7.2 软件中的Cyto
nCA 插件对图A进行筛选，得到图B 网络，蓝色方框内为关键靶点，每条线代表靶点间的相互作用关系，说明这些靶点为龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的主要作用靶点图3 ｜ “筛选靶点-成分 ”网络Figure 3 ｜ Screening target-compo
nent network图注：图中蓝色三角形表示20 个关键靶点，青色椭圆形表示这些关键靶点所对应的药物活性成分；每条边表示药物活性成分和靶点之间的关联程度，边数越多，表示两者关联程度越高图4 ｜ “通路-关键靶点 ”网络Figure 4 ｜ Pathway-key target network图注：图中红色菱形表示关键靶点；紫色倒尖角形状表示作用通路，形状越大表示通路涉及的关键靶点越多。每条边表示关键靶点与通路之间的关系图5 ｜ 龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的相关分析Figure 5 ｜ Correlation analysis ofGuilu Erxianjiaoin the treatment of osteoarthritis正常的关节软骨是一个低氧组织，作为对低氧反应的主要调节因子，低氧诱导因子1α 能显著调节骨的发育和重建，在软骨细胞生长和分化过程中具有关键作用，软骨缺乏低氧诱导因子1α能导致大量软骨细胞死亡[38-39]。马笃军等[40]用牛膝总皂苷干预兔骨关节炎模型，发现低氧诱导因子1 信号通路在实验兔骨关节炎模型软骨修复过程中发挥了较大作用。有研究发现晚期糖基化终末产物如戊糖素在关节软骨中的含量随着年龄增长而增加，而戊糖素含量与关节软骨的胶原网络脆性具有较高联系性；此外，软骨与另一些晚期糖基化终末产物如苏阿糖等发生糖化作用后，胶原网络的刚性会发生增长，且增长幅度与晚期糖基化终末产物含量呈高相关性；胶原网络两种特性的增加则会提升其易感性，关节软骨更易发生机械损伤[41]。糖基化终末产物受体与晚期糖基化终末产物结合可以引发一系列病变，机制十分复杂。研究表明，糖基化终末产物受体与衰老、慢性炎症及细胞应激有密切联系，在细胞稳态及损伤后修复等过程中都有参与[42]。目前，中医药防治骨关节炎的临床研究和动物实验很多，但是明确针对晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路的研究仍然较少，晚期糖基化终末产物作为衰老导致骨关节炎发生的一个重要因素，中医药通过调控此信号通路防治骨关节炎的具体作用机制仍待进一步研究。此外，肥胖因素已成为骨关节炎患者大量增加的一个重要原因之一，肥胖导致的慢性轻度炎症与骨关节炎进程密切相关。Toll 样受体是一类非特异性免疫受体，其家族成员Toll 样受体4 在肥胖相关的骨关节炎进程中有至关重要的作用，阻断Toll 样受体4 信号通路即可起到治疗肥胖相关骨关节炎的作用[43]，但是目前对中医药防治肥胖相关骨关节炎的研究相对较少，因此可以进一步开展相关研究。文章运用网络药理学的研究技术预测了龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的潜在活性成分、关键靶点及其作用途径网络，为更深入地探讨其作用机制以及更广泛地应用于临床提供了一定依据。另一方面以文献挖掘得出的信息进行比对，得出对此次龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用靶点、作用网络具有一定的预测性和准确性，但是在预测结果中仍有部分活性成分、靶点及作用网络的临床及基础验证不足，在后期可对这些活性成分、靶点及作用网络进行进一步验证，为临床的应用服务提供更充足的证据。作者贡献：实验设计由第一作者完成，文献收集与修改校正由其他作者共同完成。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81973880)、福建省自然科学基金面上项目(2019J01349)”的基金资助，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] SILVERWOOD V, BLAGOJEVIC-BUCKNALL M, JINKS C, et al. Current evidence on risk factors for knee osteoarthritis in older adults: a systematic review and me
taanalysis. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(4):507-515.[2] LANE NE, BRANDT K, HAWKER G, et al. OARSIFDA initiative: defining the disease state of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2011;19(5):478-482.[3] 中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)[J].康复学报,2019,29(3):1-7.[4] 林嘉辉,陈炳艺,李楠.龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的研究概况[J].中华中医药杂志,2017,32(12):5509-5512.[5] 姜灵.龟鹿二仙胶汤治疗肝肾亏虚型膝关节骨性关节炎的临床疗效研究[D].大连:大连医科大学,2016.[6] 刘俊锋.龟鹿二仙胶汤对膝骨关节炎早期干预的临床研究[D].成都:成都中医药大学,2013.[7] 张农.龟鹿二仙胶治疗老年增生性骨关节炎的临床观察[J].中医临床研究,2012,4(13):79-80.[8] 余添赐.龟鹿二仙胶不同提取部位对体外培养豚鼠关节软骨细胞活性的影响[D].福州:福建中医药大学,2014.[9] 李楠,杜江,黄远鹏,等.龟鹿二仙胶及其拆方对SD 大鼠膝骨关节炎的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(6):1677-1680.[10] 杜江,黄远鹏,李奕修,等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响[J].中医正骨,2013,25(3):11-20.[11] 杜江,黄远鹏,李奕修,等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠关节软骨中Bax和Bcl-2 的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2013,21(3):4-7.[12] 刘艾林,杜冠华.网络药理学:药物发现的新思想[J].药学学报,2010,45(12):1472-1477.[13] 许海玉,黄璐琦,卢鹏,等.基于体内ADME过程和网络药理学的中药现代研究思路[J].中国中药杂志,2012,37(2):142-145.[14] XU X, ZHANG W, HUANG C, et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 2012;13(6):6964-6982.[15] LI J, ZHAO P, LI Y, et al. Systems pharmacologyba
sed dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chro
nic obstructive pulmo
nary disease. Sci Rep. 2015;5(1):15290.[16] 侯磊,李晓宇,黄娜娜,等.四逆散干预焦虑症作用机制的网络药理学分析[J].中草药,2019,50(21):5154-5161.[17] SZKLARCZYK D, MORRIS J H, COOK H, et al. The STRING databa
se in 2017: quality-co
ntrolled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D362-D368.[18] 张新雨,黄娜娜,孙凯滨,等.柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压作用网络与机制预测[J].中草药,2019,50(21):5162-5169.[19] KANZAKI N, SAITO K, MAEDA A, et al. Effect of a dietary supplement co
ntaining glucosamine hydrochloride, cho
ndroitin sulfate and quercetin glycosides on symptomatic knee osteoarthritis: a randomized, double-blind,placebo-co
ntrolled study. J Sci Food Agric.2012;92(4):862-869.[20] LEYVA-LOPEZ N, GUTIERREZ-GRIJALVA E P, AMBRIZ-PEREZ D L, et al. Flavo
noids as cytokine modulators: a possible therapy for inflammation-related diseases. Int J Mol Sci.2016;17(6):921.[21] QIU L, LUO Y, CHEN X. Quercetin attenuates mitocho
ndrial dysfunction and biogenesis via upregulated AMPK/SIRT1 signaling pathway in OA rats. Biomed Pharmacother.2018;103:1585-1591.[22] BRITTI D, CRUPI R, IMPELLIZZERI D, et al. A novel composite formulation of palmitoylethanolamide and quercetin decreases inflammation and relieves pain in inflammatory and osteoarthritic pain models.BMC Vet Res. 2017;13(1): 229.[23] HALEAGRAHARA N, HODGSON K, MIRANDAHERNANDEZ S, et al. Flavo
noid quercetinmethotrexate combination inhibits inflammatory mediators and matrix me
talloproteinase ex
pression, providing protection to joints in collagen-induced arthritis. Inflammopharmacology. 2018;26(5):1219-1232.[24] HU Y, GUI Z, ZHOU Y, et al. Quercetin alleviates rat osteoarthritis by inhibiting inflammation and apoptosis of chondrocytes, modulating synovial macrophages polarization to M2 macrophages. Free Radic Biol Med. 2019;145:146-160.[25] ZHUANG Z, YE G, HUANG B. Kaempferol Alleviates the Interleukin-1beta-Induced Inflammation in Rat Osteoarthritis Cho
ndrocytes via Suppression of NF-kappaB.Med Sci Monit. 2017;23:3925-3931.[26] DE PAZ-LUGO P, LUPIANEZ JA, MELENDEZHEVIA E. High glycine co
ncentration increases collagen synthesis by articular cho
ndrocytes in vitro: acute glycine deficiency could be an im
portant cause of osteoarthritis. Amino Acids.2018,50(10):1357-1365.[27] 王志平,禹博,刘明皓,等.大豆苷元对人成骨细胞经典的雌激素受体信号通路的调节作用[J].武警后勤学院学报(医学版),2018,27(3):200-203.[28] 王健,陶海荣.雌激素及相关化合物干预骨关节炎作用机制:关节保护与骨软骨细胞的修复[J].中国组织工程研究,2014,18(33):5372-5376.[29] 黎立,李晓旭,司裕,等.人参皂苷Rb2 保护关节软骨细胞对抗氧化应激的作用机制研究[J].中国矫形外科杂志,2018,26(9):845-849.[30] WANG W, ZENG L, WANG ZM, et al. Ginsenoside Rb1 inhibits matrix me
talloproteinase 13 through down-regulating Notch signaling pathway in osteoarthritis. Exp Biol Med(Maywood). 2015;240(12):1614-1621.[31] 段超.人参皂苷Rg1 防治兔膝关节骨性关节炎的实验研究[D].武汉:湖北中医药大学,2016.[32] 黄威,尹宗生.炎症与骨关节炎软骨退变[J].中国矫形外科杂志,2019,27(5):448-452.[33] SOHN DH, SOKOLOVE J, SHARPE O, et al.Plasma proteins present in osteoarthritic synovial fluid can stimulate cytokine production via Toll-like receptor 4. Arthritis Res Ther. 2012;14(1):R7.[34] CHOCKALINGAM PS, VARADARAJAN U,SHELDON R, et al. Involvement of protein kinase Czeta in interleukin-1beta induction of ADAMTS-4 and type 2 nitric oxide synthase via NF-kappaB signaling in primary human osteoarthritic chondrocytes. Arthritis Rheum.2007;56(12):4074-4083.[35] 陈喜德,魏波,杨柳菁,等.不同病期骨关节炎大鼠关节软骨中caspase-3 与细胞凋亡的相关性[J].广东医学,2018,39(2):181-186.[36] 冯顶丽,卓丽丹,芦笛,等.微小RNA 调节间充质干细胞软骨分化机制的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2018,45(6):640-645.[37] WU Y H, LIU W, ZHANG L, et al. Effects of microRNA-24 targeting C-myc on apoptosis,proliferation, and cytokine ex
pressions in cho
ndrocytes of rats with osteoarthritis via MAPK signaling pathway. J Cell Biochem. 2018;119(10):7944-7958.[38] 邵进,张岩,王治,等.低氧诱导因子-1α 参与骨发育及骨代谢调控的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2015,21(3):349-355.[39] 田大川,李海乐,肖大伟,等.联合应用软骨再生支架与突变型HIF-1α 修饰BMSCs 分泌的外泌体对晚期软骨缺损修复的促进作用[J].吉林大学学报(医学版),2018,44(2):216-222.[40] 马笃军,彭力平,余阗,等.牛膝总皂苷对骨关节炎模型兔软骨修复及低氧诱导因子1 信号通路的影响[J].中国组织工程研究,2019,23(27):4332-4337.[41] 孙志江.自噬在晚期糖基化终产物诱导的软骨细胞凋亡中的作用[D].兰州:兰州大学,2018.[42] SORCI G, RIUZZI F, GIAMBANCO I, et al. RAGE in tissue homeostasis, repair and regeneration.Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Mol Cell Res. 2013;1833(1):101-109.[43] 徐小磊.TLR4/Akt/FoxO1 轴在白藜芦醇抗肥胖相关骨性关节炎中的作用研究[D].沈阳:中国医科大学,2019.
文章来源：中医药文化 网址: http://zyywh.400nongye.com/lunwen/itemid-6981.shtml
上一篇： 中医药人才培养新模式
下一篇： 文化论文_国家文化惠民工程在全面建成小康社会中的成就、贡献与经验
